Identification of Host Factors Required for the Cytolytic Activity of Hemolysin from Uropathogenic Escherichia coli

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Summary    Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are the causative agent in over 80% of urinary tract infections (UTIs).  On average, 8-­9 million people are treated for uncomplicated UTIs and over 1 million people are diagnosed  with hospital-­acquired UTIs annually in the US. Complications of UPEC infections include recurrent UTIs,  ascending infection into the ureters and kidneys resulting in pyelonephritis, and in severe cases, urosepsis and  death. Identifying and characterizing the mechanistic functions of UPEC virulence factors will lead to improved  prevention protocols and treatment for complicated UTIs. The hemolysin exotoxin (HlyA) is an important UPEC  virulence factor. HlyA is expressed in 31-­48% of E. coli recovered from uncomplicated UTIs, while in strains  isolated from cases of pyelonephritis or urosepsis, 50-­78% of strains express HlyA. At high doses, HlyA is  cytotoxic to a wide range of cell types and species, although the mechanism for initiating cell death remains  unclear. The proposed research will test the hypothesis that a host receptor or signaling pathway is subverted  by HlyA to cause cell death. A genome-­wide selection of a CRISPR/Cas9 mutated library of eukaryotic cells  was performed to identify host factors that are required for HlyA-­mediated cell death. Two hits were identified,  the integrin b2 subunit and signal peptide peptidase-­like protein 3 (SPPL3), a protease involved in regulation of  cellular glycosylation. This research plan is designed to validate the top candidates by discrete CRISPR/Cas9  mediated genome targeting to disrupt genes of interest. Preliminary data in cell lines with the subunits of b2  family integrins targeted for disruption individually reveals that none of the individual alpha subunits of b2  integrins are necessary for HlyA cytotoxicity. The sufficiency of the four possible b2 family members for HlyA  cytotoxicity will be assess in this proposal. Based on the receptor range for HlyA, the interaction of HlyA with b2  family integrins will be characterized using site-­directed mutagenesis targeting regions of interest. The role of  SPPL3 in HlyA mediated cytotoxicity will be validated by genetic disruption using CRISPR/Cas9. A protease-­ deficient form of SPPL3, which cannot regulate glycosylation, will be used to complement SPPL3-­deficient  cells to investigate additional roles for SPPL3 in HlyA cytotoxicity. The glycosylation state of b2 family integrins  will be examined in SPPL3 deficient and overexpressing cell lines. Finally, the receptor-­mediated activity of  HlyA will be examined in a species specific manner. Human cells expressing b2 receptors are 100-­fold more  sensitive to HlyA cytotoxic activity than mouse cells expressing b2 receptors. If the interaction is species  specific, in vivo work in the mouse model cannot accurately assess the role of HlyA in human UPEC infections  and the generation of a humanized mouse model will be warranted. This work will provide important insight into  the mechanistic function of HlyA-­mediated cytotoxicity and provide the groundwork for therapeutic intervention  in complicated UTIs.