Identification of Host Factors Required for the Cytolytic Activity of Hemolysin from Uropathogenic Escherichia coli

项目总结： -- 尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)是超过80%的尿路感染(UTIs)的主要致病原菌。 平均而言，约有800-900万人因不复杂的尿路感染而接受治疗，超过100万人被诊断为尿路感染。 由于医院获得的尿路感染在美国北部每年都会发生。UPEC感染的并发症包括复发的尿路感染。 感染上升至输尿管和肾脏，导致肾盂肾炎，严重病例继发尿路感染和尿毒症。 死亡。通过识别和表征UPEC的毒力和因素的主要机制和功能，将不会导致它们的改善。 对复杂的尿路感染的预防、治疗方案和治疗方案。溶血素和外毒素(HlyA)是UPEC的一个重要组成部分。 毒力是一个因素。HlyA基因在31%-48%的大肠杆菌中表达，这些大肠杆菌是从一种简单的尿路感染中回收的，而在其他菌株中也是如此。 从肾盂肾炎或尿毒症的病例中分离出的菌株中，约有50%-78%的菌株在高剂量下表达HlyA，即HlyA。 细胞毒性作用导致广泛的细胞死亡类型和物种，尽管启动细胞死亡的主要机制仍然存在。 目前还不清楚。新提出的研究小组将不会测试一种新的假设，即一种新的宿主受体或信号转导途径被颠覆。 由HlyA突变导致细胞死亡。由真核生物干细胞的一个突变的CRISPR/Cas9基因文库的全基因组选择。 进行了进一步的检查，以确定HlyA介导的细胞死亡所必需的宿主因素。我们发现了两个新的命中率。 整合素2亚基和信号转导蛋白SPPL3是一种重要的蛋白水解酶，参与细胞周期的调控。 细胞糖基化。这项新的研究计划旨在通过独立的CRISPR/Cas9来更好地验证它们的最佳候选者。 介导的基因组靶向实验旨在打乱他们感兴趣的基因序列。初步的实验数据显示，在细胞系中发现了与bb2的主要亚基相似的基因。 家族整合素是针对基因干扰的靶向基因，个别研究显示，没有一个人是2的主要个体和α-亚基。 整合素对HlyA的细胞毒作用是必要的，四个可能的家族成员对HlyA的细胞毒作用是不够的。 在这项新的提案中，将不会对其细胞毒性进行评估。根据HlyA与2的主要相互作用范围，确定HlyA与HlyA的相互作用范围。 家族整合素基因的特点是使用定点突变和靶向感兴趣的区域。这是基因的主要作用。 SPPL3在HlyA介导的细胞毒性实验中的作用将通过使用CRISPR/Cas9进行遗传干扰来验证。 SPPL3的缺陷形式，它不能很好地调节糖基化，它将被用来补充SPPL3缺陷。 细胞需要进一步研究Spl3家族在HlyA细胞毒性中的额外作用，以及2家族整合素的糖基化和状态调节。 将进一步研究SPPL3缺陷基因和过表达的细胞系中的基因。最后，研究SPPL3受体介导的DNA活性变化。 HlyA受体将以不同的物种和特定的方式进行进一步检查。表达-2受体的人类干细胞数量将增加100倍甚至更多。 对HlyA的细胞毒活性比对表达2受体的小鼠骨髓细胞更敏感。如果它们的相互作用是不同物种的话。 具体地说，在体内，我们无法准确地评估HlyA基因在人类UPEC感染中的重要作用。 而下一代的人性化鼠标模型也将是没有根据的。这项新的工作将为我们提供一个重要的市场洞察力。 HlyA介导的细胞毒作用机制的研究为其治疗和干预提供了重要的基础性研究。 在复杂的尿路感染中。

Project Summary    Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are the causative agent in over 80% of urinary tract infections (UTIs).  On average, 8-­9 million people are treated for uncomplicated UTIs and over 1 million people are diagnosed  with hospital-­acquired UTIs annually in the US. Complications of UPEC infections include recurrent UTIs,  ascending infection into the ureters and kidneys resulting in pyelonephritis, and in severe cases, urosepsis and  death. Identifying and characterizing the mechanistic functions of UPEC virulence factors will lead to improved  prevention protocols and treatment for complicated UTIs. The hemolysin exotoxin (HlyA) is an important UPEC  virulence factor. HlyA is expressed in 31-­48% of E. coli recovered from uncomplicated UTIs, while in strains  isolated from cases of pyelonephritis or urosepsis, 50-­78% of strains express HlyA. At high doses, HlyA is  cytotoxic to a wide range of cell types and species, although the mechanism for initiating cell death remains  unclear. The proposed research will test the hypothesis that a host receptor or signaling pathway is subverted  by HlyA to cause cell death. A genome-­wide selection of a CRISPR/Cas9 mutated library of eukaryotic cells  was performed to identify host factors that are required for HlyA-­mediated cell death. Two hits were identified,  the integrin b2 subunit and signal peptide peptidase-­like protein 3 (SPPL3), a protease involved in regulation of  cellular glycosylation. This research plan is designed to validate the top candidates by discrete CRISPR/Cas9  mediated genome targeting to disrupt genes of interest. Preliminary data in cell lines with the subunits of b2  family integrins targeted for disruption individually reveals that none of the individual alpha subunits of b2  integrins are necessary for HlyA cytotoxicity. The sufficiency of the four possible b2 family members for HlyA  cytotoxicity will be assess in this proposal. Based on the receptor range for HlyA, the interaction of HlyA with b2  family integrins will be characterized using site-­directed mutagenesis targeting regions of interest. The role of  SPPL3 in HlyA mediated cytotoxicity will be validated by genetic disruption using CRISPR/Cas9. A protease-­ deficient form of SPPL3, which cannot regulate glycosylation, will be used to complement SPPL3-­deficient  cells to investigate additional roles for SPPL3 in HlyA cytotoxicity. The glycosylation state of b2 family integrins  will be examined in SPPL3 deficient and overexpressing cell lines. Finally, the receptor-­mediated activity of  HlyA will be examined in a species specific manner. Human cells expressing b2 receptors are 100-­fold more  sensitive to HlyA cytotoxic activity than mouse cells expressing b2 receptors. If the interaction is species  specific, in vivo work in the mouse model cannot accurately assess the role of HlyA in human UPEC infections  and the generation of a humanized mouse model will be warranted. This work will provide important insight into  the mechanistic function of HlyA-­mediated cytotoxicity and provide the groundwork for therapeutic intervention  in complicated UTIs.