Single-molecule resolution of RNA editing of mRNAs: visualizing GRIA2 editing in situ in ALS

项目总结

Project Summary  Much of the basic biology of mRNA editing remains unknown despite decades of study, largely due to  the limitations of existing experimental methods. Adenosine to Inosine (A to I) editing­­a result of adenosine  deamination catalyzed by deaminases such as ADAR enzymes­­is one of the most common forms of  post­transcriptional chemical modification of RNA, generally known as RNA editing. A to I editing is essential  for not only non­coding RNA function, such as rRNA and tRNA higher­order structure stabilization, but also for  post­transcriptional mRNA regulation. For example, GRIA2, which encodes the GluR2 subunit of the AMPA  glutamate receptor, has a highly conserved ADAR2­targeted editing site in its coding sequence. Perturbation of  the orthologous rat Gria2 editing event leads to neurological dysfunction. In humans with Amyotrophic Lateral  Sclerosis (ALS), many disease­affected motor neurons appear to die as a result of glutamatergic calcium  toxicity and have deficient GRIA2 editing, and Adar2 knockout mice demonstrate an ALS­like phenotype, which  is rescued upon exogenous expression of edited Gria2. GRIA2 and several other mRNA A to I editing targets  have been studied for more than twenty years, and over the last four years transcriptome­wide surveys of A to  I editing have provided evidence for many more mRNA targets. Despite this motivation, much basic information  about the biology of this important mRNA regulatory process, including its sub­cellular localization, timing  relative to transcription, and association with other regulatory factors, remains unknown largely due to the limits  of experimental techniques.   Recently, our laboratory described a fluorescence ​in situ ​hybridization method for visualizing and  quantifying single­nucleotide variants (SNVs) in single cells using a novel probe hybridization strategy known  as SNV FISH. We are leveraging inosine's structure as a guanosine analog to adapt SNV FISH to the analysis  of A to I editing in a protocol we refer to as inosine FISH (iFISH). Our preliminary data show that we can use  iFISH to specifically identify edited and unedited GRIA2 transcripts i​n situ ​in cultured cells. In this project, we  are quantifying sub­single­cellular trends in A to I editing of known targets, such as GRIA2 and mRNA targets  newly identified in transcriptome­wide screens. Specifically, we are using iFISH to measure single­cell editing  rate distributions, to visualize sub­cellular localization patterns of edited mRNAs, and to measure editing timing  relative to transcription. We are also studying the effect of ADAR2 on sub­cellular GRIA2 trafficking. Lastly, we  are applying our novel method toward better characterizing perturbations of GRIA2 editing in individual motor  neurons in ALS lesions by extending the use of iFISH to fixed sections of post­mortem brain and spinal cord  tissue samples from healthy and diseased donors.