Dopamine Transporter Cell Surface Dynamics

多巴胺转运蛋白细胞表面动力学

基本信息

项目摘要

PROJECT SUMMARY Extracellular dopamine (DA) levels in the brain directly impact a variety of physiological functions, including movement, cognition and reward. Following synaptic release, DA availability is limited by presynaptic reuptake, mediated by the plasma membrane DA transporter (DAT). DAT is a member of the SLC6 carrier gene family and is the primary target for addictive and therapeutic psychostimulants, such as amphetamine, cocaine and methylphenidate (Ritalin) as well as for antidepressants, such as bupropion (Wellbutrin). These drugs potently inhibit DA uptake, and thereby increase extracellular DA concentrations, enhance neuronal signaling and significantly modulate DA-related behaviors. Thus, DAT activity and availability critically determine normal DA neurotransmission and psychoactive drug efficacy. DAT plasma membrane presentation is not static. Rather, DAT is dynamically shuttled to and from the plasma membrane by constitutive endocytic trafficking. Protein kinase C (PKC) activation and amphetamine (AMPH) exposure modulate DAT internalization and recycling rates, ultimately decreasing DAT surface availability. Recent studies in an ADHD pedigree have identified a DAT mutant that has altered DAT trafficking kinetics, both under basal and AMPH- stimulated conditions, and altered targeting to membrane raft microdomains, thereby implicating altered DAT trafficking in human disease. However, studies investigating DAT endocytic mechanisms have yielded conflicting results and DAT cell surface behavior is not well defined. The major goal of these studies is directly examine DAT surface dynamics by TIRF microscopy in living cells and to elucidate the endocytic mechanisms that mediate basal and regulated DAT internalization. Specifically, we aim to (1) characterize the surface dynamics of wildtype and trafficking mutant DATs, (2) test the hypothesis that basal, PKC- and AMP-stimulated DAT endocytosis are clathrin-independent and Cdc42-dependent, and (3) test the hypothesis that DAT internalization is a dynamin-independent process. These hypotheses stem from strong preliminary data that demonstrate 1) DAT surface localization primarily to clathrin-independent foci, 2) dynamin-independent DAT trafficking and 3) Cdc42-dependent DAT endocytosis. For live TIRF imaging studies, we capitalize on a novel chemical biology approach that directly couples fluorophore to cell surface DAT. This innovative technique will facilitate the first direct examination of DAT surface dynamics without binding to bulky antibodies or inhibitory ligands. Complementary biochemical studies will be performed both in neuronal cell lines and mouse striatal slices, utilizing small molecule clathrin, dynamin and Cdc42 inhibitors to acutely perturb membrane trafficking, as well as standard shRNA and GTPase mutant approaches. The information gleaned from these studies will provide a clearer understanding of DAT surface dynamics and the mechanisms mediating DAT endocytosis, both for wildtype and trafficking mutants. We anticipate that our findings will greatly impact future strategies aimed at treating affective disorders and drug addiction. Moreover, the results will undoubtedly enhance our understanding of the molecular factors influencing DA availability in the brain.
项目摘要 脑中细胞外多巴胺(DA)水平直接影响多种生理功能,包括 运动、认知和奖励。突触释放后,DA的可用性受到突触前神经元的限制。 再摄取,由质膜DA转运蛋白(DAT)介导。DAT是SLC 6运营商的成员 基因家族,并且是成瘾性和治疗性精神兴奋剂,如安非他明, 可卡因和哌甲酯(利他林)以及抗抑郁药,如安非他酮(安非他酮)。这些 药物有效地抑制DA摄取,从而增加细胞外DA浓度,增强神经元 信号传导并显著调节DA相关行为。因此,DAT活动和可用性 确定正常DA神经传递和精神活性药物的疗效。DAT质膜呈递 不是静止的。相反,DAT通过组成性内吞作用动态地穿梭于质膜和从质膜穿梭。 贩卖人口蛋白激酶C(PKC)激活和安非他明(AMPH)暴露调节DAT 内化和再循环率,最终降低DAT表面可用性。多动症的最新研究 一个家系已经确定了一个DAT突变体,它改变了DAT运输动力学,在基础和AMPH- 刺激的条件,并改变靶向膜筏微结构域,从而涉及改变DAT 贩卖人类疾病然而,研究DAT内吞机制的研究已经产生了 相互矛盾的结果和DAT细胞表面行为没有很好地定义。这些研究的主要目的是直接 在活细胞中通过TIRF显微镜检查DAT表面动力学,并阐明内吞机制 介导基础和调节DAT内化。具体而言,我们的目标是(1)表征表面 野生型和运输突变体DAT的动力学,(2)测试基础,PKC-和AMP-刺激 DAT的内吞作用是网格蛋白非依赖性和Cdc 42依赖性的,(3)验证了DAT内吞作用的假说, 内化是一个独立于动力的过程。这些假设源于强有力的初步数据, 证明1)DAT表面定位主要为网格蛋白非依赖性病灶,2)动力蛋白非依赖性DAT 3)Cdc 42依赖的DAT内吞作用。对于实时TIRF成像研究,我们利用一种新的 化学生物学方法,直接耦合荧光团细胞表面DAT。这种创新技术将 促进DAT表面动力学的首次直接检查,而不结合大体积抗体或抑制性抗体。 配体。将在神经元细胞系和小鼠纹状体中进行补充生物化学研究。 切片,利用小分子网格蛋白,发动蛋白和Cdc 42抑制剂急性扰动膜运输, 以及标准的shRNA和GT3突变体方法。从这些研究中收集的信息将 更清楚地了解DAT表面动力学和介导DAT内吞作用的机制, 野生型和运输突变体。我们预计,我们的发现将极大地影响未来的战略, 旨在治疗情感障碍和毒瘾。此外,这些结果无疑将提高我们的 了解影响大脑中DA可用性的分子因素。

项目成果

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