Exocytosis of Lytic granules

溶解颗粒的胞吐作用

基本信息

  • 批准号:
    9925235
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 30.62万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2017
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2017-06-01 至 2022-02-28
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ABSTRACT Many vital cellular processes such as neuronal communication, insulin secretion and immune responses rely upon highly regulated fusion events between cargo containing vesicles and target membranes. All these processes require the assembly between vesicular (v-) SNARE and target (t-) SNARE proteins into a single SNARE complex, which brings the bilayers into close proximity and triggers their fusion. Sec1/Munc18 (SM) family proteins and calcium sensor bind to and modulate the function of specific sets of SNARE proteins in different cell types in many different ways not yet well understood. The goal of this project is to shed light into the mechanisms by which SM proteins and calcium sensors control granule exocytosis by focusing on the exocytosis of lytic granules (LGs) in cytotoxic t-cells as a model system. Insights into the molecular machinery that drives LG exocytosis emerged from genetic analyses of Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis (FHL) patients in which LG exocytosis is impaired. With this completely novel approach we will exploit the slower kinetics, well-defined steps during LG exocytosis, and the higher energetic barrier imposed by the atypical lipid-anchored SNARE (STX11) involved in this fusion event, to dissect how SM proteins and calcium sensors control SNARE machinery during exocytosis. Using an in vitro “flipped” cell-cell fusion assay developed in our lab, we found that lipid-anchored STX11 mainly supports hemifusion. Strikingly, addition of Munc18-2 –a SM isoform of immune cells- promotes the transition from hemifusion to complete fusion suggesting that SM proteins has a direct role on membrane merging. We hypothesize that physiologically lipid- anchored STX11 mediates incomplete merging of LGs with the PM and requires an extra set of regulatory proteins – Munc18-2 and calcium sensors – for fusion pore opening and content release. To address these questions we will test: 1)- whether interactions of Munc18-2 with STX11 alone or with SNARE complexes stabilize and/or facilitate SNARE complex formation and drive membrane fusion. This will be done through a detailed protein:protein interaction analyses, functional “flipped” cell-cell fusion assays, and optical tweezers to assess the strength of forces on single SNAREs complex; 2)- how Munc18-2 controls STX11-mediated LG granule fusion at physiologically relevant immunological synapses of cultured cells and whether Munc13-4 and/or Synaptotagmin-7 confer calcium sensitivity to this process. To do this we will use TIRF-microsocpy in genetically-modified human CTLs, cell lines or FHL patient-derived cells that either lack these proteins or express functional mutant constructs. Answering these specific questions will provide insights into what SM functions are universal from those that dictate cell-type specific differences, how lipid-anchored SNAREs mediate fusion in general, how cells control a potentially dangerous exocytic event and may guide approaches to intervene in LG secretion for therapeutic gain. Moreover, while exploiting a genetic disease to dissect a basic biological process, our proposal will shed light into how defects in exocytosis contribute to diseases.
抽象的 许多重要的细胞过程,如神经元通讯、胰岛素分泌和免疫反应都依赖于 基于含有囊泡的货物和目标膜之间高度调节的融合事件。所有这些 过程需要将囊泡 (v-) SNARE 和目标 (t-) SNARE 蛋白组装成单个 SNARE 复合体,使双层靠近并触发它们的融合。 Sec1/Munc18 (SM) 家族蛋白和钙传感器结合并调节特定 SNARE 蛋白组的功能 不同的细胞类型以许多不同的方式尚未被充分理解。该项目的目标是揭示 SM 蛋白和钙传感器通过关注颗粒胞吐作用来控制颗粒胞吐作用的机制 细胞毒性 T 细胞中溶解颗粒 (LG) 的胞吐作用作为模型系统。对分子机械的见解 家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的基因分析发现了驱动 LG 胞吐作用的因素 (FHL) LG 胞吐作用受损的患者。通过这种全新的方法,我们将利用 LG 胞吐作用过程中较慢的动力学、明确的步骤以及由 非典型脂质锚定 SNARE (STX11) 参与了这一融合事件,以剖析 SM 蛋白和钙如何 传感器在胞吐作用期间控制 SNARE 机械。使用体外“翻转”细胞-细胞融合测定 我们实验室开发的,我们发现脂质锚定的STX11主要支持半融合。引人注目的是,添加 Munc18-2——免疫细胞的 SM 亚型——促进从半融合到完全融合的转变 表明 SM 蛋白对膜合并有直接作用。我们假设生理上的脂质 锚定的 STX11 介导 LG 与 PM 的不完全合并,需要一套额外的监管 蛋白质 – Munc18-2 和钙传感器 – 用于融合孔开放和内容物释放。为了解决这些 我们将测试的问题:1)- Munc18-2 是否与 STX11 单独相互作用或与 SNARE 复合物相互作用 稳定和/或促进 SNARE 复合物形成并驱动膜融合。这将通过一个 详细的蛋白质:蛋白质相互作用分析、功能性“翻转”细胞-细胞融合测定以及光镊 评估单个 SNARE 复合体上的力量强度; 2)- Munc18-2如何控制STX11介导的LG 培养细胞的生理相关免疫突触处的颗粒融合以及 Munc13-4 是否 和/或 Synaptotagmin-7 赋予钙对此过程的敏感性。为此,我们将使用 TIRF-microsocpy 基因修饰的人类 CTL、细胞系或 FHL 患者来源的细胞,这些细胞要么缺乏这些蛋白质,要么 表达功能突变体构建体。回答这些具体问题将有助于深入了解 SM 的含义 功能与那些决定细胞类型特异性差异的功能是通用的,如何脂质锚定 SNARE 一般来说,介导融合、细胞如何控制潜在危险的胞吐事件并可能指导方法 干预 LG 分泌以获得治疗效果。此外,在利用遗传疾病来剖析 基本的生物过程,我们的建议将揭示胞吐作用的缺陷如何导致疾病。

项目成果

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