Development and Applications of Unnatural Organisms with a 21 Amino Acid Genetic Code

项目概要/摘要 在大多数生物体中，遗传密码由64个核苷酸三联体组成，编码20个氨基酸构建 用于蛋白质合成的块。 PI研究计划的总体目标是开发 跨学科的工具来重新编程遗传密码，以精确探测和操纵生物系统。 重新编程遗传密码的核心是我们能够将非规范氨基酸（ncAA）添加到蛋白质中， 兴趣该提案的总体目标是开发能够生物合成和利用ncAA的细胞，并探索 这些非天然生物体在蛋白质进化和治疗开发中的效用。为了实现这一目标， 第一个研究方向将集中在产生完全自主的生物体与各种21世纪 个氨基酸具有第21个氨基酸的原核和真核细胞将具有生物合成途径， 用于新氨基酸结构单元的生物正交氨酰-tRNA合成酶（阿尔斯）/tRNA对。 的 ncAA的生物合成途径将从其他物种或通过代谢再利用获得。 至工地- 将这些ncAA特异性地整合到蛋白质中，我们将进化出生物正交的阿尔斯/tRNA对，并将它们 到细胞。 由此产生的具有第21个氨基酸的生物体将允许具有新的氨基酸的蛋白质的进化。 活动以及新疗法的开发。 为了进化新的或增强的酶活性， 通过20个典型氨基酸可访问，将在 非天然生物体，并进行基于荧光素酶激活细胞分选（FACS）的流式细胞仪或存活 选择. 进化的ncAA-依赖性酶可用于防止非预期的细胞增殖， 转基因生物或制备自养疫苗。 接下来，我们将探讨这些工具的实用性。 用于治疗开发的额外蛋白质构建模块的非天然生物。 原核和 能够生物合成和利用具有生物正交柄的氨基酸的真核细胞将用于产生 具有优化的治疗功效的抗体变体。 具有额外结构单元的工程化免疫细胞 将允许重定向嵌合抗原受体（CAR）-β免疫细胞的特异性，从而提供免疫应答。 新的设计策略，用于可转换的CAR-1免疫细胞。 我们在这个项目中的努力将产生一系列 生物与额外的氨基酸构建块，并将导致通用平台的ncAA-基于 蛋白质进化或治疗性蛋白质，可能会彻底改变现代医学。

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT    In  most  organisms,  the  genetic  code,  consisting  of  64  triplets  of  nucleotides,  encodes  20  amino  acid  building  blocks  used  in  the  synthesis  of  proteins.  The  overall  goal  of  the  PI’s  research  program  is  to  develop  interdisciplinary  tools  to  reprogram  the  genetic  code  to  precisely  probe  and  manipulate  biological  systems.  Central to reprogramming the genetic code is our ability to add noncanonical amino acids (ncAAs) to proteins of  interest. The overall goal of this proposal is to develop cells able to biosynthesize and utilize ncAAs and explore  the utility or these unnatural organisms in protein evolution and therapy development. To achieve this goal, the  first  research  direction  will  focus  on  the  generation  of  completely  autonomous  organisms  with  a  variety  of  21st  amino acids. The prokaryotic and eukaryotic cells with the 21st amino acid will harbor a biosynthetic pathway and  a  bioorthogonal  aminoacyl-­tRNA  synthetase  (aaRS)/tRNA  pair  for  the  new  amino  acid  building  block.  The  biosynthesis  pathway  of  ncAAs  will  be  obtained  from  other  species  or  via  metabolic  repurposing.  To  site-­ specifically incorporate these ncAAs into proteins, we will evolve bioorthogonal aaRS/tRNA pairs and add them  to  the  cells.  The  resulting  organisms  with  a  21st  amino  acids  will  allow  for  the  evolution  of  proteins  with  novel  activities  as  well  as  the  development  of  new  therapies.  To  evolve  novel  or  enhanced  enzyme  activity  not  accessible by the 20 canonical amino acids, a library of ncAA-­containing enzyme mutants will be generated in  the  unnatural  organisms  and  subjected  to  a  fluorescence-­activated  cell  sorting  (FACS)-­based  or  survival  selection.  The  evolved  ncAA-­dependent  enzymes  can  be  used  to  prevent  the  unintended  proliferation  of  genetically  modified  organisms  or  to  prepare  autotrophic  vaccines.  Next,  we  will  explore  the  utility  of  these  unnatural  organisms  with  additional  protein  building  blocks  for  therapeutic  development.  The  prokaryotic  and  eukaryotic cells able to biosynthesize and utilize amino acids with bioorthogonal handles will be used to produce  antibody  variants  with  optimized  therapeutic  efficacy.  Engineered  immune  cells  with  additional  building  blocks  will allow for the redirection of the specificity of chimeric antigen receptor (CAR)-­immune cells, thus providing a  new  design  strategy  for  switchable  CAR-­immune  cells.  Our  efforts  in  this  project  will  yield  a  collection  of  organisms  with  additional  amino  acids  building  blocks,  and  will  result  in  versatile  platforms  for  ncAA-­based  protein evolution or therapeutic proteins that could revolutionize modern medicine.