Development and Applications of Unnatural Organisms with a 21 Amino Acid Genetic Code

点击翻译按钮获取中文摘要

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT    In  most  organisms,  the  genetic  code,  consisting  of  64  triplets  of  nucleotides,  encodes  20  amino  acid  building  blocks  used  in  the  synthesis  of  proteins.  The  overall  goal  of  the  PI’s  research  program  is  to  develop  interdisciplinary  tools  to  reprogram  the  genetic  code  to  precisely  probe  and  manipulate  biological  systems.  Central to reprogramming the genetic code is our ability to add noncanonical amino acids (ncAAs) to proteins of  interest. The overall goal of this proposal is to develop cells able to biosynthesize and utilize ncAAs and explore  the utility or these unnatural organisms in protein evolution and therapy development. To achieve this goal, the  first  research  direction  will  focus  on  the  generation  of  completely  autonomous  organisms  with  a  variety  of  21st  amino acids. The prokaryotic and eukaryotic cells with the 21st amino acid will harbor a biosynthetic pathway and  a  bioorthogonal  aminoacyl-­tRNA  synthetase  (aaRS)/tRNA  pair  for  the  new  amino  acid  building  block.  The  biosynthesis  pathway  of  ncAAs  will  be  obtained  from  other  species  or  via  metabolic  repurposing.  To  site-­ specifically incorporate these ncAAs into proteins, we will evolve bioorthogonal aaRS/tRNA pairs and add them  to  the  cells.  The  resulting  organisms  with  a  21st  amino  acids  will  allow  for  the  evolution  of  proteins  with  novel  activities  as  well  as  the  development  of  new  therapies.  To  evolve  novel  or  enhanced  enzyme  activity  not  accessible by the 20 canonical amino acids, a library of ncAA-­containing enzyme mutants will be generated in  the  unnatural  organisms  and  subjected  to  a  fluorescence-­activated  cell  sorting  (FACS)-­based  or  survival  selection.  The  evolved  ncAA-­dependent  enzymes  can  be  used  to  prevent  the  unintended  proliferation  of  genetically  modified  organisms  or  to  prepare  autotrophic  vaccines.  Next,  we  will  explore  the  utility  of  these  unnatural  organisms  with  additional  protein  building  blocks  for  therapeutic  development.  The  prokaryotic  and  eukaryotic cells able to biosynthesize and utilize amino acids with bioorthogonal handles will be used to produce  antibody  variants  with  optimized  therapeutic  efficacy.  Engineered  immune  cells  with  additional  building  blocks  will allow for the redirection of the specificity of chimeric antigen receptor (CAR)-­immune cells, thus providing a  new  design  strategy  for  switchable  CAR-­immune  cells.  Our  efforts  in  this  project  will  yield  a  collection  of  organisms  with  additional  amino  acids  building  blocks,  and  will  result  in  versatile  platforms  for  ncAA-­based  protein evolution or therapeutic proteins that could revolutionize modern medicine.