Arg and cortactin regulation of the Arp2/3 complex and its role in dendritic spine stability

Arp2/3 复合物的 Arg 和 cortactin 调节及其在树突棘稳定性中的作用

• 批准号: 9794652
• 负责人: Juliana Gentile
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: YALE UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2018-09-14 至 2020-04-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9794652
• 关键词: Actins; Address; Adolescence; Affect; Affinity; Behavior; Binding; Biochemical; Biological Assay; Chemicals; Color; Complement; Complex; Confocal Microscopy; Cytoskeleton; Data; Dendritic Spines; Disease; EMS1 gene; Economic Burden; F-Actin; Filament; Fluorescence Recovery After Photobleaching; Foundations; Hippocampus (Brain); Learning; Left; Maintenance; Measures; Mediating; Mental disorders; Methods; Microscopy; Modeling; Neurons; Pathology; Photobleaching; Protein Tyrosine Kinase; Proteins; Recovery; Regulation; Research; Role; Structure; Synapses; Testing; Therapeutic Intervention; Time; Total Internal Reflection Fluorescent; Vertebral column; Work; base; cohort; crosslink; experimental study; interdisciplinary approach; knock-down; mutant; nervous system disorder; neuron loss; premature; recruit; single molecule; social

Project Summary   Dendritic spine stability is disrupted in psychiatric and neurological disorders. Dendritic spines are enriched in a  highly branched cytoskeleton, containing stable and dynamic filamentous-­ (F-­) actin pools and monomeric actin.  Loss of the Abl2/Arg non-­receptor tyrosine kinase (Arg) and its interaction partner cortactin from dendritic spines  causes  widespread  spine  loss  in  late  adolescence,  but  the  mechanisms  of  how  these  two  proteins  support  dendritic  spine  stability  remain  elusive.  Our  lab  recently  showed,  using  total  internal  reflection  microscopy  (TIRFM)  single-­filament  based  assays,  that  Arg  and  cortactin  synergize  to  regulate  Arp2/3-­mediated  actin  branching.  Coordinated  regulation  of  the  Arp2/3  complex  via  Arg  and  cortactin  is  a  plausible  mechanism  by  which these proteins support spine stability. In my research plan, I will test the hypothesis that Arg and cortactin  interact  to  confer  dendritic  spine  stability  via  regulation  of  the  Arp2/3  complex  and  maintenance  of  the  spine  stable actin pool.  Aim 1. To determine how Arg interacts with cortactin and the Arp2/3 complex to promote actin branch  nucleation.  It  remains  unresolved  how  Arg  regulates  the  Arp2/3  complex  and  how  cortactin  coordinates  with  Arg  to  enhance  this  effect.  To  address  how  Arg  regulates  the  complex,  I  will  learn  how  to  conduct  functional  TIRFM single-­ filament based assays to define the minimal domain of Arg that is sufficient to activate the Arp2/3  complex. My preliminary data indicate that Arg can directly bind the Arp2/3 complex. I will expand these binding  assays and learn how to conduct chemical crosslinking experiments to determine (1) the minimal Arg fragment  that can make a high affinity interaction with the Arp2/3 complex and (2) the subdomain contacts through which  Arg interacts with the Arp2/3 complex, respectively. Finally, I will develop two methods to determine how cortactin  can  coordinate  with  Arg  to  stimulate  Arp2/3  activation.  Two-­color  single  molecule  TIRF  assays  will  address  if  cortactin  recruits  Arg  to  branch  points  and  competition  binding  assays  will  determine  if  cortactin  functions  (mechanistically) to release Arg from nascent branch points, allowing filament elongation.  Aim  2.  To  determine  the  mechanisms  through  which  Arg  and  cortactin  regulate  spine  stability.  Arg,  cortactin  and  the  Arp2/3  complex  are  concentrated  in  dendritic  spines  and  each  is  required  for  spine  stability,  but how they interact to confer this stability is not understood. Preliminary data collected in the lab suggests that  loss of cortactin initially reduces stable F-­actin prior to dendritic spine destabilization. Using well-­defined Arg or  cortactin mutants, I will perform knockdown/complementation and confocal microscopy in cultured hippocampal  neurons to determine how disruptions of Arp2/3 complex regulation affect spine dynamic behavior and stability.  I will use GFP-­actin fluorescent recovery after photobleaching (FRAP), employing the approaches used by my  collaborator, with the same mutant cohort to determine how these proteins impact spine stability via control of  the stable and dynamic actin pools.

项目摘要   树突脊柱的稳定性在精神和神经疾病中受到破坏。 树突棘富含  高度分支的细胞骨架，包含稳定和动态的丝状-(F-)肌动蛋白池和单体肌动蛋白。  树突棘中 Abl2/Arg 非受体酪氨酸激酶 (Arg) 及其相互作用伙伴皮质蛋白的丢失  在青春期后期导致广泛的脊柱损失，但是这两种蛋白质如何支持的机制  树突棘的稳定性仍然难以捉摸。  我们的实验室最近展示了使用全内反射显微镜  (TIRFM) 基于单丝的测定，Arg 和 cortactin 协同调节 Arp2/3 介导的肌动蛋白  分枝。  通过 Arg 和 cortactin 协调 Arp2/3 复合物的调节是一种合理的机制  这些蛋白质支持脊柱稳定性。 在我的研究计划中，我将测试以下假设：Arg 和 cortactin  通过调节 Arp2/3 复合物和维持脊柱相互作用，赋予树突脊柱稳定性  稳定的肌动蛋白池。  目标 1. 确定 Arg 如何与 Cortactin 和 Arp2/3 复合物相互作用以促进肌动蛋白分支  成核。  Arg 如何调节 Arp2/3 复合物以及 cortactin 如何与  Arg 可以增强这种效果。  为了解决 Arg 如何调节复合体的问题，我将学习如何进行功能性  基于 TIRFM 单丝的测定可定义足以激活 Arp2/3 的 Arg 的最小结构域  复杂的。 我的初步数据表明 Arg 可以直接结合 Arp2/3 复合物。 我将扩展这些绑定  分析并学习如何进行化学交联实验以确定 (1) 最小 Arg 片段  可以与 Arp2/3 复合体进行高亲和力交互，并且 (2) 子域通过其进行接触  Arg 分别与 Arp2/3 复合体相互作用。 最后，我将开发两种方法来确定 cortactin  可以与 Arg 协调刺激 Arp2/3 激活。  双色单分子 TIRF 检测将解决以下问题：  cortactin 将 Arg 招募到分支点，竞争结合测定将确定 cortactin 是否发挥作用  （机械地）从新生分支点释放 Arg，从而使丝伸长。  目标 2. 确定精氨酸和皮质素调节脊柱稳定性的机制。  精氨酸，  cortactin 和 Arp2/3 复合物集中在树突棘中，每一个都是树突棘稳定性所必需的，  但它们如何相互作用以赋予这种稳定性尚不清楚。 实验室收集的初步数据表明  在树突棘不稳定之前，皮质蛋白的丧失首先会降低稳定的 F-肌动蛋白。 使用明确定义的 Arg 或  cortactin 突变体，我将在培养的海马中进行敲低/互补和共焦显微镜检查  神经元来确定 Arp2/3 复合体调节的破坏如何影响脊柱的动态行为和稳定性。  我将使用光漂白后的 GFP-肌动蛋白荧光恢复 (FRAP)，采用我的方法  合作者，使用相同的突变体队列来确定这些蛋白质如何通过控制来影响脊柱稳定性  稳定和动态肌动蛋白池。