REPROGRAMMING BOTULINUM NEUROTOXIN PROTEASES THROUGH CONTINUOUSEVOLUTION AS A STRATEGY FOR DEVELOPING SELECTIVE INTRACELLULAR THERAPIES

项目总结： 在过去的几十年里，中国医学界也见证了中国的医疗卫生结构发生了显著的变化。 药物治疗从传统的小分子药物发展到生物大分子药物，尽管它们具有巨大的潜力。 成功的大分子药物治疗一直以来都是有限的，几乎完全是针对细胞外药物靶点，这是由于药物的作用。 重大的挑战是将他们可控的基因传递到细胞质中。他们需要克服这一关键的基因障碍。 随着大分子药物治疗范围的扩大，自然会出现自我递送的蛋白质治疗系统，例如。 肉毒杆菌和神经毒素(BoNTs)将提供一个非常有吸引力的解决方案。这些蛋白质和复合体可以识别胆碱能。 神经元、胆碱和胆碱能促进最活跃的红细胞膜毒素组分，也就是蛋白质水解酶进入细胞质。 在那里，它可以通过蛋白质分解来使负责膜和融合事件的主要细胞调节机制失活。 强效、高效、高效的水解酶是高度特异的催化剂，它们通常只能识别一个单一的底物。 为了重新编程Bont LLC的最新活动规则，他们已经取得了有限的成功，解决了新规则的难以访问的问题。 蛋白水解酶的细胞内靶点仍然是扩大邦特来源的治疗药物的主要障碍。 策略。最近，噬菌体辅助的持续生物进化技术(PACE)已经成为快速发展的一个强大的技术工具。 这种新颖的酶活性、蛋白质和蛋白质的进化论已经被广泛应用于研究病毒和蛋白酶的作用机制的最新探索。 发展对酶抑制剂、酶和酶的抗药性，以促进病毒蛋白水解酶中不断进化的新的酶底物和活性。这项工作将不会延长。 新的步伐和战略需要重新编程Bont F和LC和蛋白酶，以切割新的靶基因序列，这些序列和序列将不会被广泛应用。 为了解决VAMP7细胞内蛋白水解酶的失活问题，研究了与VAMP7治疗相关的蛋白质VAMP7。 请记住，这项建议的主要目标是：(1)适应目前最新的蛋白酶和PACE平台，以供其使用。 蛋白水解酶和;(2)进化成一种新的蛋白质，可以选择性地切割VAMP7中的蛋白质；VAMP7(2)将以更快的速度发展。 负面的选择规则和规则适用于这个新的选择规则，以进化出能以高度特异性切割VAMP7基因的邦特·Lc和蛋白酶；;。 (3)深入表征这些蛋白水解酶的活性、特异性、安全性和潜在的治疗相关性。 这项新的工作将为我们提供一个强大的技术基础，在此基础上，我们可以为未来的催化和胞内蛋白水解酶的治疗提供一个新的方法。 基于。

PROJECT SUMMARY  Over  the  last  few  decades,  the  medical  community  has  witnessed  a  remarkable  shift  in  the  composition  of  pharmaceutical  therapies  from  traditional  small  molecules  to  biomacromolecules.  Despite  their  tremendous  success,  macromolecular  therapies  have  been  limited  almost  exclusively  to  extracellular  targets  due  to  the  significant  challenge  of  their  controllable  delivery  into  the  cytoplasm.  To  overcome  this  critical  barrier  in  expanding the scope of macromolecuar therapy, naturally occurring self-­deliverable protein systems such as the  Botulinum  neurotoxins  (BoNTs)  offer  an  attractive  solution.  These  protein  complexes  recognize  cholinergic  neurons, and promote the translocation of the active toxin component, the BoNT LC protease, into the cytosol  where it deactivates the cellular machinery responsible for membrane fusion events through proteolysis. While  potent, BoNT LC proteases are highly specific catalysts, and generally only recognize a single substrate. Efforts  to reprogram the activity of BoNT LC proteases have met with limited success, and the inaccessibility of new  intracellular targets for BoNT LC proteases remains the primary barrier in extending BoNT-­derived therapeutic  strategies. Recently, phage assisted continuous evolution (PACE) has emerged as a powerful tool for the rapid  evolution of novel activity, and has been applied to the exploration of the mechanisms by which viral proteases  develop resistance to inhibitors, and to evolving new substrate activities in viral proteases. This work will extend  the PACE strategy to reprogram the BoNT F LC protease to cleave novel target sequences, and will be applied  to  the  intracellular  proteolytic  deactivation  of  the  therapeutically  relevant  SNARE  protein  VAMP7.  With  this  in  mind,  the  goals  of  this  proposal  are:  (1)  adapt  the  current  protease  PACE  platform  for  use  with  BoNT  LC  proteases and evolve a BoNT LC protease to selectively cleave the SNARE protein VAMP7;; (2) develop a PACE  negative selection and apply this selection to evolve BoNT LC proteases that cleave VAMP7 with high specificity;;  (3) characterize in depth the activity, specificity, and potential therapeutic relevance of the evolved proteases.  This  work  will  provide  a  strong  foundation  upon  which  future  catalytic  intracellular  protease  therapies  can  be  based.