Molecular mechanisms of microbial complex carbohydrate secretion

点击翻译按钮获取中文摘要

Antibiotic-­resistant  pathogens  pose  a  significant  threat  to  human  health.  The  NIH  identified  several  Gram-­ negative  species  of  particular  concern  due  to  increasing  antibiotic  resistances.  The  cell  envelope  of  Gram-­ negative  bacteria  consists  of  two  membranes  and  lipopolysaccharides  (LPS)  form  an  important  component  of  the  extracellular  leaflet  of  the  outer  membrane.  LPS  are  important  cell  wall  components  that  control  diffusion  across the outer membrane, stabilize the cell envelope, and assist in escaping host immune defenses, among  other functions. Impaired LPS biosynthesis correlates with increased susceptibility to antimicrobial treatments.  LPS  contain  a  conserved  core,  consisting  of  lipid-­A  attached  to  an  oligosaccharide  backbone,  and  a  hypervariable  region,  called  the  O  antigen.  O  antigens  are  primarily  linear  complex  carbohydrates  that  reduce  the  efficacy  of  complement-­mediated  cell  lysis  and  phagocytosis  as  part  of  the  innate  immune  response.  O  antigens  are  synthesized  via  two  fundamentally  different  mechanisms.  One  pathway  relies  on  assembling  the  polymers  from  short  oligosaccharides  in  the  periplasm,  the  other  involves  moving  fully-­assembled  O  antigens  from the cytosolic to the periplasmic side of the inner membrane with the help of an ABC transporter. Not only  is  ABC  transporter-­mediated  secretion  of  O  antigens  an  important  process  for  microbial  pathogenicity,  the  transport  of  a  substrate  several  times  the  size  of  the  ABC  transporter  itself  is  fascinating  from  a  molecular  level.  Taking  advantage  of  an  already  determined  O  antigen-­translocating  ABC  transporter  structure,  we  propose  a  structural  biology  approach  to  unravel  the  mechanism  of  O  antigen  translocation  and  to  identify  unique features of the O antigen that regulate transporter activity.    ABC  transporters  use  ATP  binding  and  hydrolysis  to  cycle  between  conformations  that  mediate  substrate  translocation. Our O antigen ABC transporter structure represents a nucleotide-­free conformation, in which the  transporter  forms  a  continuous  channel  across  the  membrane  that  could  accommodate  a  translocating  O  antigen.  We  speculate  that  conformational  changes  associated  with  nucleotide  binding  induce  O  antigen  translocation  by  about  1-­2  sugar  units  per  ATP  hydrolyzed.  To  reveal  the  molecular  mechanism  of  O  antigen  translocation,  we  seek  to  determine  the  structure  of  the  ABC  transporter  in  a  nucleotide-­bound  closed  conformation  (Aim  1).  Further,  many  bacterial  species  signal  completion  of  O  antigen  biosynthesis  by  modifying  the  polymer’s  growing  end  with  specific  groups,  such  as  carbohydrate,  phosphate,  or  methyl  moieties.  These  ‘capped  O  antigens’  can  only  be  exported  by  transporters  containing  a  carbohydrate-­binding  domain  (CBD)  attached  to  their  nucleotide-­binding  domain.  This  domain  was  removed  from  our  O  antigen  transporter  to  facilitate  crystallization.  To  reveal  how  the  CBD  binds  its  substrate  and  modulates  transporter  functions, we propose to determine the structure and substrate binding properties of the isolated CBD (Aim 2A)  and to determine the architecture of the CBD-­containing full-­length O antigen transporter (Aim 2B).