Molecular mechanisms of microbial complex carbohydrate secretion

抗生素耐药病原体对人类健康构成重大威胁。 美国国立卫生研究院发现了几种革兰氏阴性杆菌， 由于抗生素耐药性增加，特别关注的阴性种属。 革兰氏阴性菌的细胞膜 阴性细菌由两层膜组成，脂多糖（LPS）是其重要组成部分。 外膜的细胞外小叶。 LPS是控制扩散的重要细胞壁成分 穿过外膜，稳定细胞包膜，并协助逃避宿主的免疫防御， 其他功能。受损的LPS生物合成与对抗菌治疗的敏感性增加相关。 LPS含有保守的核心，由连接到寡糖骨架的脂质-CoA组成，和 高变区，称为O抗原。 O抗原主要是线性复合碳水化合物， 补体介导的细胞溶解和吞噬作用作为先天免疫应答的一部分的功效。 O 抗原通过两种根本不同的机制合成。 一种途径依赖于组装 另一种是从周质中的短寡糖聚合物，另一种是移动完全组装的O抗原 在ABC转运蛋白的帮助下从胞质到内膜的周质侧。不仅 ABC转运蛋白介导的O抗原分泌是微生物致病的重要过程， 从分子水平上看，运输几倍于ABC转运蛋白本身大小的底物是令人着迷的。 水平 利用一个已经确定的O抗原-γ-氨基转移ABC转运蛋白结构，我们 提出了一种结构生物学方法来解开O抗原易位的机制，并确定 调节转运蛋白活性的O抗原的独特特征。 ABC转运蛋白利用ATP结合和水解在介导底物的构象之间循环 易位我们的O抗原ABC转运蛋白结构代表了一种无核苷酸构象， 转运蛋白形成一个连续的跨膜通道，可以容纳转运的O 抗原的 我们推测与核苷酸结合相关的构象变化诱导O抗原 每水解一个ATP，转运约1- 102个糖单位。 揭示O抗原的分子机制 易位，我们试图确定ABC转运蛋白的结构，在一个核苷酸结合的封闭 构象（目的1）。 此外，许多细菌物种通过以下方式发出0抗原生物合成完成的信号： 用特定基团如碳水化合物、磷酸盐或甲基修饰聚合物的生长末端 部分。 这些“加帽的O抗原”只能通过含有碳水化合物结合的转运蛋白输出。 结构域（CBD）连接到它们的核苷酸结合结构域。 这个结构域从我们的O抗原中被移除 转运体，以促进结晶。 揭示CBD如何结合其底物并调节转运蛋白 功能，我们建议，以确定结构和底物结合特性的分离CBD（目的2A） 并确定含有CBD-β的全长O抗原转运蛋白（Aim 2B）的结构。

Antibiotic-­resistant  pathogens  pose  a  significant  threat  to  human  health.  The  NIH  identified  several  Gram-­ negative  species  of  particular  concern  due  to  increasing  antibiotic  resistances.  The  cell  envelope  of  Gram-­ negative  bacteria  consists  of  two  membranes  and  lipopolysaccharides  (LPS)  form  an  important  component  of  the  extracellular  leaflet  of  the  outer  membrane.  LPS  are  important  cell  wall  components  that  control  diffusion  across the outer membrane, stabilize the cell envelope, and assist in escaping host immune defenses, among  other functions. Impaired LPS biosynthesis correlates with increased susceptibility to antimicrobial treatments.  LPS  contain  a  conserved  core,  consisting  of  lipid-­A  attached  to  an  oligosaccharide  backbone,  and  a  hypervariable  region,  called  the  O  antigen.  O  antigens  are  primarily  linear  complex  carbohydrates  that  reduce  the  efficacy  of  complement-­mediated  cell  lysis  and  phagocytosis  as  part  of  the  innate  immune  response.  O  antigens  are  synthesized  via  two  fundamentally  different  mechanisms.  One  pathway  relies  on  assembling  the  polymers  from  short  oligosaccharides  in  the  periplasm,  the  other  involves  moving  fully-­assembled  O  antigens  from the cytosolic to the periplasmic side of the inner membrane with the help of an ABC transporter. Not only  is  ABC  transporter-­mediated  secretion  of  O  antigens  an  important  process  for  microbial  pathogenicity,  the  transport  of  a  substrate  several  times  the  size  of  the  ABC  transporter  itself  is  fascinating  from  a  molecular  level.  Taking  advantage  of  an  already  determined  O  antigen-­translocating  ABC  transporter  structure,  we  propose  a  structural  biology  approach  to  unravel  the  mechanism  of  O  antigen  translocation  and  to  identify  unique features of the O antigen that regulate transporter activity.    ABC  transporters  use  ATP  binding  and  hydrolysis  to  cycle  between  conformations  that  mediate  substrate  translocation. Our O antigen ABC transporter structure represents a nucleotide-­free conformation, in which the  transporter  forms  a  continuous  channel  across  the  membrane  that  could  accommodate  a  translocating  O  antigen.  We  speculate  that  conformational  changes  associated  with  nucleotide  binding  induce  O  antigen  translocation  by  about  1-­2  sugar  units  per  ATP  hydrolyzed.  To  reveal  the  molecular  mechanism  of  O  antigen  translocation,  we  seek  to  determine  the  structure  of  the  ABC  transporter  in  a  nucleotide-­bound  closed  conformation  (Aim  1).  Further,  many  bacterial  species  signal  completion  of  O  antigen  biosynthesis  by  modifying  the  polymer’s  growing  end  with  specific  groups,  such  as  carbohydrate,  phosphate,  or  methyl  moieties.  These  ‘capped  O  antigens’  can  only  be  exported  by  transporters  containing  a  carbohydrate-­binding  domain  (CBD)  attached  to  their  nucleotide-­binding  domain.  This  domain  was  removed  from  our  O  antigen  transporter  to  facilitate  crystallization.  To  reveal  how  the  CBD  binds  its  substrate  and  modulates  transporter  functions, we propose to determine the structure and substrate binding properties of the isolated CBD (Aim 2A)  and to determine the architecture of the CBD-­containing full-­length O antigen transporter (Aim 2B).