Molecular mechanisms of microbial complex carbohydrate secretion

微生物复合碳水化合物分泌的分子机制

• 批准号: 10238961
• 负责人: Jochen Zimmer
• 金额: $ 28.82万
• 依托单位: UNIVERSITY OF VIRGINIA
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2018-09-01 至 2022-08-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10238961
• 关键词: ATP phosphohydrolase; ATP-Binding Cassette Transporters; Affect; Anabolism; Animals; Antibiotic Resistance; Antibiotics; Architecture; Bacillus anthracis; Binding; Biopolymers; Burkholderia pseudomallei; Carbohydrates; Cell Wall; Cell surface; Cells; Centers for Disease Control and Prevention (U.S.); Complement; Complementarity Determining Regions; Complex; Cryoelectron Microscopy; Crystallization; Cytolysis; Data; Detergents; Diffusion; Ebola virus; Escherichia coli; Francisella tularensis; Gram-Negative Bacteria; Health; Human; Hydrolysis; Immune; Impairment; Individual; Innate Immune Response; Length; Ligand Binding; Lipid A; Lipids; Lipopolysaccharide Biosynthesis Pathway; Lipopolysaccharides; Marburgvirus; Mediating; Membrane; Modeling; Molecular; Molecular Conformation; Molecular Weight; Nucleotides; O Antigens; Oligosaccharides; Pathogenicity; Pathway interactions; Phagocytosis; Polymers; Polysaccharides; Positioning Attribute; Predisposition; Process; Property; Protein Engineering; Salmonella; Side; Signal Transduction; Site; Structure; Teichoic Acids; Temperature; Time; Transmembrane Domain; Transport Process; United States National Institutes of Health; Vertebral column; analog; antimicrobial; base; cell envelope; crosslink; drug resistant pathogen; extracellular; fascinate; foodborne illness; human pathogen; in vivo; inorganic phosphate; insight; microbial; multi-drug resistant pathogen; mutant; novel; pathogen; periplasm; polypeptide; prevent; reconstitution; solute; structural biology; sugar

Antibiotic-­resistant  pathogens  pose  a  significant  threat  to  human  health.  The  NIH  identified  several  Gram-­ negative  species  of  particular  concern  due  to  increasing  antibiotic  resistances.  The  cell  envelope  of  Gram-­ negative  bacteria  consists  of  two  membranes  and  lipopolysaccharides  (LPS)  form  an  important  component  of  the  extracellular  leaflet  of  the  outer  membrane.  LPS  are  important  cell  wall  components  that  control  diffusion  across the outer membrane, stabilize the cell envelope, and assist in escaping host immune defenses, among  other functions. Impaired LPS biosynthesis correlates with increased susceptibility to antimicrobial treatments.  LPS  contain  a  conserved  core,  consisting  of  lipid-­A  attached  to  an  oligosaccharide  backbone,  and  a  hypervariable  region,  called  the  O  antigen.  O  antigens  are  primarily  linear  complex  carbohydrates  that  reduce  the  efficacy  of  complement-­mediated  cell  lysis  and  phagocytosis  as  part  of  the  innate  immune  response.  O  antigens  are  synthesized  via  two  fundamentally  different  mechanisms.  One  pathway  relies  on  assembling  the  polymers  from  short  oligosaccharides  in  the  periplasm,  the  other  involves  moving  fully-­assembled  O  antigens  from the cytosolic to the periplasmic side of the inner membrane with the help of an ABC transporter. Not only  is  ABC  transporter-­mediated  secretion  of  O  antigens  an  important  process  for  microbial  pathogenicity,  the  transport  of  a  substrate  several  times  the  size  of  the  ABC  transporter  itself  is  fascinating  from  a  molecular  level.  Taking  advantage  of  an  already  determined  O  antigen-­translocating  ABC  transporter  structure,  we  propose  a  structural  biology  approach  to  unravel  the  mechanism  of  O  antigen  translocation  and  to  identify  unique features of the O antigen that regulate transporter activity.    ABC  transporters  use  ATP  binding  and  hydrolysis  to  cycle  between  conformations  that  mediate  substrate  translocation. Our O antigen ABC transporter structure represents a nucleotide-­free conformation, in which the  transporter  forms  a  continuous  channel  across  the  membrane  that  could  accommodate  a  translocating  O  antigen.  We  speculate  that  conformational  changes  associated  with  nucleotide  binding  induce  O  antigen  translocation  by  about  1-­2  sugar  units  per  ATP  hydrolyzed.  To  reveal  the  molecular  mechanism  of  O  antigen  translocation,  we  seek  to  determine  the  structure  of  the  ABC  transporter  in  a  nucleotide-­bound  closed  conformation  (Aim  1).  Further,  many  bacterial  species  signal  completion  of  O  antigen  biosynthesis  by  modifying  the  polymer’s  growing  end  with  specific  groups,  such  as  carbohydrate,  phosphate,  or  methyl  moieties.  These  ‘capped  O  antigens’  can  only  be  exported  by  transporters  containing  a  carbohydrate-­binding  domain  (CBD)  attached  to  their  nucleotide-­binding  domain.  This  domain  was  removed  from  our  O  antigen  transporter  to  facilitate  crystallization.  To  reveal  how  the  CBD  binds  its  substrate  and  modulates  transporter  functions, we propose to determine the structure and substrate binding properties of the isolated CBD (Aim 2A)  and to determine the architecture of the CBD-­containing full-­length O antigen transporter (Aim 2B).

对抗生素具有耐药性的病原体可能对人类健康构成重大威胁。美国国立卫生研究院发现了几种革兰氏杆菌。 尤其令人担忧的负面细菌物种是由于越来越多的人对抗生素产生耐药性。在革兰氏阴性杆菌的包膜上 阴性菌由两层膜和内毒素组成，内毒素是细菌的重要组成部分。 内毒素是控制细胞扩散的重要细胞壁组分，它是细胞外膜的重要组成部分。 在整个外膜上，它们稳定细胞的包膜，帮助它们逃脱宿主的免疫系统防御，等等。 其他功能。内毒素生物合成受损与患者对抗菌素治疗的敏感性增加有关。 脂蛋白含有一个保守的核心层，由脂类组成，附着体是低聚糖的主干，包括蛋白质和蛋白质。 高变区，被称为OO抗原。OO抗原主要是线性的、复杂的碳水化合物，可以减少血液中的蛋白质。 补体介导的细胞裂解和巨噬细胞吞噬的有效作用是先天免疫应答的一部分。 抗原是通过两种根本不同的作用机制合成的，其中一种途径依赖于细胞的组装。 聚合物来自于胞质中的短链低聚糖，而另一种则涉及移动完全组装的OO抗原。 从胞浆蛋白到胞质蛋白，再到细胞内膜的周质蛋白，都要借助一位美国广播公司的基因转运蛋白。 研究表明，ABC转运蛋白介导的O蛋白抗原分泌过程是微生物致病性的一个重要过程。 一种生物底物的运输成本是美国广播公司生物转运体自身大小的几倍，这从一个生物分子的角度来看是非常吸引人的。 水平。我们正在利用一个已经确定的OO抗原-转移ABC的转运体结构的优势，我们。 提出了一种新的结构生物学方法来解开O抗原易位基因的作用机制，并对其进行鉴定。 独一无二的是，它具有一种可以调节细胞转运蛋白活性的O蛋白抗原蛋白。 ABC转运蛋白可以使用ATP结合酶和水解酶来调节介导底物的构象之间的循环。 易位。我们的O蛋白抗原和ABC转运蛋白的结构代表了一种无核苷酸的DNA构象，这就是我们的基因。 转运者在膜上形成了一个连续的运输通道，它可以容纳一个运输运输的运输通道。 抗原。我们可能推测，与核苷酸结合相关的构象变化可能会诱发OO抗原。 易位是由大约1-2个糖单位引起的，每个单位的ATP被水解，以进一步揭示O-O蛋白抗原的主要分子调控机制。 易位，那么我们就可以寻求方法来确定在一个与核苷酸结合的基因关闭的过程中，ABC基因转运蛋白的结构是否正确。 构象(目标1)。此外，许多不同的细菌物种将发出信号，表明人类完成了O抗原的生物合成。 用几个特定的基团来修饰这种聚合物不断增长的末端，例如碳水化合物、磷酸酯、甲基亚胺或甲基。 部分。只有运输公司才能将这些被封顶的碳水化合物抗原出口到国外。 结构域基因(CBD)被附加到它们的核苷酸结合的结构域上。但是这个结构域基因被从我们的OO抗原上移除了。 Transporter旨在促进其结晶。旨在揭示CBD如何与其主要底物结合，并进一步调制Transporter。 在功能方面，我们将提出一种方法来确定第一个孤立的商业中心商务区(Aim 2a)的结构和衬底的结合性能。 并试图确定包含全长OO抗原和转运体基因(AIM-2B)的CBD的最新架构。