Mechanism of Cellulose Synthesis and Transport Across Biological Membranes

点击翻译按钮获取中文摘要

Cellulose  is  the  most  abundant  biopolymer  on  earth.  It  is  a  linear  polymer  of  glucose  molecules  primarily  formed  by  vascular  plants  but  also  by  green  algae,  bacteria,  and  even  tunicates.  Bacterial  cellulose  is  frequently  found  in  biofilms,  which  are  sessile  bacterial  communities  encased  in  a  3-­dimensional  matrix  of  polysaccharides, proteinaceous fibers, and nucleic acids. Biofilm bacteria are less susceptible to anti-­microbial  treatments and are responsible for about 80% of hospital-­derived infections, thereby posing a significant risk to  human  health.  Developing  novel  therapeutics  to  treat  or  prevent  biofilm  infections  requires  a  detailed  mechanistic understanding of how the biofilm constituents, in particular polysaccharides, are synthesized and  deposited outside the cell. The proposed research seeks to provide this information.  Bacterial  cellulose  biosynthesis  is  an  ideal  model  system  to  study  the  mechanism  and  regulation  of  exo-­ polysaccharide  secretion.  Gram-­negatives  produce  and  secrete  cellulose  via  a  multi-­subunit  complex  consisting  of  the  inner  membrane  BcsA  and  BcsB  subunits,  the  periplasmic  BcsZ  hydrolase,  as  well  as  the  outer  membrane  subunit  BcsC.  Our  previous  work  provided  detailed  mechanistic  insights  into  how  the  inner  membrane-­integrated BcsA-­B complex elongates the cellulose chain and translocates the polymer across the  plasma membrane. While current data explain how cellulose is extended, we currently have no information on  how cellulose biosynthesis initiates. This question will be addressed biochemically in Aim 1a by reconstituting  the initiation reaction in vitro from cell-­free expressed 'uninitiated' cellulose synthase.      BcsA  processively  elongates  cellulose  and  pushes  the  polymer  into  a  transmembrane  channel  formed  by  its  own  membrane-­spanning  region.  Structural  snapshots  of  different  cellulose  synthase  states  during  cellulose  synthesis and membrane translocation provide insights into conformational changes during this process. Yet a  precise  analysis  of  energetic  requirements  for  and  processivity  rates  of  cellulose  translocation  is  currently  missing. We will address these questions on a single molecule level using an optically trapped and catalytically  active BcsA-­B complex in Aim 1b.   Past the inner membrane and in Gram-­negatives, cellulose must cross the periplasm and the outer membrane  before  reaching  the  biofilm  matrix.  This  section  of  the  translocation  path  is  most  likely  formed  by  a  direct  interaction of periplasmic and outer membrane components with the BcsA-­B complex at the inner membrane.  In  Aim  2  we  seek  to  reconstitute  outer  membrane  transport  of  cellulose  from  nanodisc  and  proteoliposome-­ reconstituted  components  for  detailed  kinetic,  biochemical,  and  interaction  studies.  This  information  will  support  our  efforts  to  determine  the  structure  of  an  inner  and  outer  membrane-­spanning  cellulose  synthase  complex  as  outlined  in  Aim  3.  We  will  use  X-­ray  crystallography  and/or  electron  microscopy  to  determine  the  structure of individual periplasmic and outer membrane components as well as their complexes with BcsA-­B.