Rotavirus Genome Replication and Virion Assembly

项目摘要/摘要列表(说明)：1 -- RNA和病毒可能是毁灭性的人类疾病病原体，可能会给人类社会带来巨大的医疗负担和经济负担。 (例如，SARS-病毒、甲型流感病毒、埃博拉病毒、轮状病毒等)。虽然这些病毒可能有很大的不同。 戏剧性地改变了它们的致病机制，因为它们可以分享一个共同的复制和特征-它们必须合成一种新的DNA RNA。 分子来自于核糖核酸和模板。由于宿主细胞核酶缺乏这种活性，核糖核酸和病毒可以编码一种特殊的蛋白质。 依赖于RNA的核糖核酸聚合酶(RdRp)。这些病毒的RdRps在结构上是不同的，在功能上是保守的。 不同的病毒核糖核酸可以直接催化病毒转录和基因组复制的所有阶段。 然而，这些酶很少单独在受感染的细胞的环境中发挥作用。相反，这些病毒的RdRps基因被紧紧地联系在一起。 受多亚基转录酶/复制酶复合体中其他蛋白质的调节，从而最大限度地增加蛋白质的种类和数量。 病毒核糖核酸合成的时机选择。这一应用程序的总体和客观评估旨在进一步获得对RdRp的机械性和洞察力。 轮状病毒是一种由11个节段组成的双链核糖核酸(DS)核糖核酸病毒，它能导致致命的腹泻。 在一些幼儿中，轮状病毒VP1和RdRp只有在结合到VP2核心外壳下的时候才能发挥作用。 一层完整的、部分或部分完整的粒子。在早期的粒子组装过程中，VP2激活了VP1的接合状态。 RdRp的功能如此之强，以至于它的功能就像一个DNA复制酶，将包装好的、单链的和阳性的DNA转化为(+)RNA。 模板进入dsRNA的基因组片段。早期的DNA组装由中间产物组成，然后再变形为双层结构。 颗粒，其中与VP2结合的VP1和RdRp通过开关调节转录酶的活性，以及利用DNA合成DNA+RNA。 DsRNA是模板。尽管如此，我们知识中的主要差距仍然是关于将VP1和RdRp作为一个新的复制酶的结构。 在dsRNA的合成过程中，通过调节VP2的核心和外壳蛋白来调节其功能。在这里，我们在体外建立了一个成熟的模型。 生化技术和基因工程技术与最先进的结构工程方法相结合，可以有效地弥合这些差距。 在这些知识的基础上，让我们对轮状病毒RdRp的监管有了更深刻的理解。我们将进一步阐明VP2的核心和外壳。 决定VP1复制酶活性的关键因素和AIM第二阶段将不会决定这是有史以来第一次在原位观察3D生物的原子结构。 VP1在冰冻(使用冷冻-EM)和液体(使用微流控系统)中都是一种新的复制酶。 这一应用程序非常重要，因为预计它将不会透露有关轮状病毒的详细结构-功能和信息。 RdRp表示，它也可以被应用于合理的、抗病毒的药物设计。

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT (DESCRIPTION):    RNA viruses can be devastating human pathogens that impart large medical and economic burdens to society  (e.g.,  SARS-­CoV-­2,  influenza  A  virus,  Ebola  virus,  rotavirus,  etc.).  While  these  viruses  can  differ  quite  dramatically  in  their  pathogenesis,  they  share  a  common  replication  feature—they  must  synthesize  new  RNA  molecules from RNA templates. Because host cell enzymes lack this activity, RNA viruses encode a specialized  RNA-­dependent  RNA  polymerase  (RdRp).  Viral  RdRps  are  structurally-­  and  functionally-­conserved  among  diverse  RNA  viral  families,  and  they  directly  catalyze  all  stages  of  viral  transcription  and  genome  replication.  However, these enzymes rarely function alone in the context of infected cells. Instead, the viral RdRps are tightly  regulated  by  other proteins  in  multi-­subunit  transcriptase/replicase  complexes  so  as  to  maximize  the  type and  timing of viral RNA synthesis. The overall objective of this application is to gain mechanistic insight into RdRp  regulation for rotavirus—an 11-­segmented, double-­stranded (ds) RNA virus that causes life-­threatening diarrhea  in young children. The rotavirus VP1 RdRp functions only when bound beneath the icosahedral VP2 core shell  layer of intact, or partially intact, particles. Engagement of VP1 by VP2 during early particle assembly activates  the  RdRp  so  that  it  functions  as  a  replicase,  converting  packaged,  single-­stranded  positive  sense  (+)  RNA  templates  into  dsRNA  genome  segments.  Early  assembly  intermediates  then  morph  into  double-­layered  particles,  wherein  the  VP2-­bound,  VP1  RdRp  switches  to  a  transcriptase  activity,  synthesizing  +RNAs  using  dsRNA  templates.  Still,  major  gaps  in  knowledge  remain  about  the  structure  of  the  VP1  RdRp  as  a  replicase  during  dsRNA  synthesis  and  its  regulation  by  the  VP2  core  shell  protein.  Here,  well-­established  in  vitro  biochemical and genetic techniques are combined with state-­of-­the-­art structural approaches to close these gaps  in knowledge and inform a deep understanding of rotavirus RdRp regulation. AIM 1 will elucidate VP2 core shell  determinants critical for VP1 replicase activity, and AIM 2 will determine the first-­ever in situ 3D atomic structures  of VP1 as a replicase in both ice (using cryo-­EM) and liquid (using a microfluidics system). The work outlined in  this application is significant, as it is expected to reveal detailed structure-­function information about the rotavirus  RdRp that could be applied to rational antiviral drug design.