Rotavirus Genome Replication and Virion Assembly

轮状病毒基因组复制和病毒粒子组装

• 批准号: 10576929
• 负责人: Deborah F Kelly
• 金额: $ 45.82万
• 依托单位: WAKE FOREST UNIVERSITY
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2022-01-14 至 2027-01-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10576929
• 关键词: 2019-nCoV; 3-Dimensional; Antiviral Agents; Armadillo Repeat; Binding; Biochemical; Biological Assay; Biological Models; Cells; Child; Complex; Cryoelectron Microscopy; Data; Defect; Diarrhea; Disease; Double Stranded RNA Virus; Double-Stranded RNA; Drug Design; Ebola virus; Economic Burden; Engineering; Enzymes; Family; Foundations; Genetic Techniques; Genetic Transcription; Genome; Genomic Segment; Ice; Image; In Situ; In Vitro; Infection; Influenza A virus; Knowledge; Lesion; Life; Liquid substance; Mammalian Cell; Maps; Medical; Microfluidics; Mission; Molecular Conformation; N-terminal; Pathogenesis; Performance; Plasmids; Proteins; Publishing; RNA; RNA Viruses; RNA chemical synthesis; RNA-Directed RNA Polymerase; Recombinants; Regulation; Reoviridae; Research; Resolution; Rotavirus; Site; Societies; Structure; System; Techniques; Testing; Transcriptase; United States National Institutes of Health; Viral; Virion; Virus; Virus Replication; Virus-like particle; Work; flexibility; human disease; human pathogen; in vitro activity; insight; mutant; particle; prevent; public health relevance; rational design; reconstruction; replicase; reverse genetics; scaffold; structural biology; three dimensional structure; viral RNA

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT (DESCRIPTION):    RNA viruses can be devastating human pathogens that impart large medical and economic burdens to society  (e.g.,  SARS-­CoV-­2,  influenza  A  virus,  Ebola  virus,  rotavirus,  etc.).  While  these  viruses  can  differ  quite  dramatically  in  their  pathogenesis,  they  share  a  common  replication  feature—they  must  synthesize  new  RNA  molecules from RNA templates. Because host cell enzymes lack this activity, RNA viruses encode a specialized  RNA-­dependent  RNA  polymerase  (RdRp).  Viral  RdRps  are  structurally-­  and  functionally-­conserved  among  diverse  RNA  viral  families,  and  they  directly  catalyze  all  stages  of  viral  transcription  and  genome  replication.  However, these enzymes rarely function alone in the context of infected cells. Instead, the viral RdRps are tightly  regulated  by  other proteins  in  multi-­subunit  transcriptase/replicase  complexes  so  as  to  maximize  the  type and  timing of viral RNA synthesis. The overall objective of this application is to gain mechanistic insight into RdRp  regulation for rotavirus—an 11-­segmented, double-­stranded (ds) RNA virus that causes life-­threatening diarrhea  in young children. The rotavirus VP1 RdRp functions only when bound beneath the icosahedral VP2 core shell  layer of intact, or partially intact, particles. Engagement of VP1 by VP2 during early particle assembly activates  the  RdRp  so  that  it  functions  as  a  replicase,  converting  packaged,  single-­stranded  positive  sense  (+)  RNA  templates  into  dsRNA  genome  segments.  Early  assembly  intermediates  then  morph  into  double-­layered  particles,  wherein  the  VP2-­bound,  VP1  RdRp  switches  to  a  transcriptase  activity,  synthesizing  +RNAs  using  dsRNA  templates.  Still,  major  gaps  in  knowledge  remain  about  the  structure  of  the  VP1  RdRp  as  a  replicase  during  dsRNA  synthesis  and  its  regulation  by  the  VP2  core  shell  protein.  Here,  well-­established  in  vitro  biochemical and genetic techniques are combined with state-­of-­the-­art structural approaches to close these gaps  in knowledge and inform a deep understanding of rotavirus RdRp regulation. AIM 1 will elucidate VP2 core shell  determinants critical for VP1 replicase activity, and AIM 2 will determine the first-­ever in situ 3D atomic structures  of VP1 as a replicase in both ice (using cryo-­EM) and liquid (using a microfluidics system). The work outlined in  this application is significant, as it is expected to reveal detailed structure-­function information about the rotavirus  RdRp that could be applied to rational antiviral drug design.

项目摘要/摘要（描述）：    RNA 病毒可能是毁灭性的人类病原体，给社会带来巨大的医疗和经济负担  （例如，SARS-CoV-2、甲型流感病毒、埃博拉病毒、轮状病毒等）。  虽然这些病毒可能有很大不同  引人注目的是，在它们的发病机制中，它们有一个共同的复制特征——它们必须合成新的 RNA  来自 RNA 模板的分子。 由于宿主细胞酶缺乏这种活性，RNA 病毒编码一种专门的  RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp)。  病毒 RdRps 在结构和功能上都是保守的  不同的 RNA 病毒家族，它们直接催化病毒转录和基因组复制的所有阶段。  然而，这些酶很少在受感染细胞的环境中单独发挥作用。 相反，病毒 RdRps 紧密相连  受多亚基转录酶/复制酶复合物中其他蛋白质的调节，以便最大限度地提高类型和  病毒 RNA 合成的时间。 该应用程序的总体目标是深入了解 RdRp 的机制  轮状病毒的监管——一种 11 段双链 (ds) RNA 病毒，可导致危及生命的腹泻  在年幼的孩子中。 轮状病毒 VP1 RdRp 仅当结合在二十面体 VP2 核壳下方时才发挥作用  完整或部分完整的颗粒层。 在早期粒子组装过程中，VP1 与 VP2 的接合激活  RdRp，使其作为复制酶发挥作用，转换包装的单链正义 (+) RNA  模板到 dsRNA 基因组片段中。  早期组装中间体然后演变成双层  颗粒，其中 VP2 结合的 VP1 RdRp 切换到转录酶活性，使用合成 +RNA  dsRNA 模板。  尽管如此，关于 VP1 RdRp 作为复制酶的结构仍然存在重大知识空白  在 dsRNA 合成过程中及其受 VP2 核壳蛋白的调节。  在这里，在体外建立良好  生化和遗传技术与最先进的结构方法相结合来缩小这些差距  知识并加深对轮状病毒 RdRp 法规的理解。 AIM 1 将阐明 VP2 核壳  对于 VP1 复制酶活性至关重要的决定因素，AIM 2 将决定首个原位 3D 原子结构  VP1 作为冰（使用冷冻电镜）和液体（使用微流体系统）中的复制酶。 概述的工作  该申请意义重大，因为它有望揭示有关轮状病毒的详细结构功能信息  RdRp 可应用于合理的抗病毒药物设计。