Using Bacterial Effectors to Uncover Innate Immune Mechanisms Restricting Viral Replication in Bat Cells

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Summary    Bats are important reservoirs for diverse viral pathogens affecting humans. However, we have a poor  understanding  of the  key bat  innate  immunity factors  that  restrict  virus  replication.  Functional  assays  that  can  identify  bat  factors  that  are  truly  relevant  to  combating  viruses  are  needed  to  understand  the  innate  immune  mechanisms that ultimately define bat susceptibility to viral infection. While historically such functional screens  have  relied  on  genome-­wide  genomic  editing  (e.g.  CRISPR-­Cas9)-­  or  RNA  interference  (RNAi)-­based  techniques, such platforms are unavailable for most bat species. Thus, new methods for uncovering functionally-­ relevant components of the bat immune response to virus infection are needed. To address this need, we have  developed  an  innovative  arbovirus  "rescue"  assay  wherein  immune  evasion  proteins  (IEPs)  encoded  by  mammalian pathogens can be expressed in bat cells and one can assay for changes in bat cell susceptibility to  arbovirus infection. Enhancement of arbovirus replication after expression of a candidate IEP indicates that the  IEP  likely  inhibits  bat  immunity  mechanisms  that  normally  restrict  arbovirus  replication.  Using  these  IEPs  as  "tools",  one  can  then  identify  the  bat  immunity  factors  these  IEPs  target.  Thus,  this  screening  methodology  provides  a  mechanism  to  both  identify  novel  IEPs  and  functionally-­relevant  components  of  the  bat  immune  response. To discover IEPs that promote arbovirus replication in bat cells, we will screen an expression library  encoding ~200 bacterial effector proteins. Bacterial effectors are proteins secreted by pathogenic bacteria into  eukaryotic  hosts  cells  that  modulate  or  inhibit  various  eukaryotic  cellular  processes  to  promote  bacterial  replication.  Many  bacterial  pathogens  that  replicate  in the  cytoplasm  of  eukaryotic  host cells  encode  effectors  that function as IEPs. Thus, we hypothesize that some effectors may suppress immune responses that restrict  both  bacteria  and  cytoplasmic  viruses  such  as  arboviruses.  Indeed,  our  initial  screens  have  identified  four  effectors  that  promote  the  replication  of  four  different  arboviruses  when  expressed  in  bat  cells.  We  have  characterized one of these effector screen "hits" as a novel ubiquitin ligase that targets an uncharacterized Ring  Finger (RNF) Domain-­containing protein for degradation in eukaryotic cells. Importantly, RNAi depletion of this  RNF factor in human and bat cells promotes arbovirus replication, suggesting that it may be a novel component  of human and bat immune responses. These results suggest that we can use bacterial effectors as tools to both  inhibit, and identify, functionally-­relevant immunity factors in bats. Our study has the following specific aims: 1)  Identify  bacterial  effector  proteins  that  promote  arbovirus  replication  in  bat  cells;;  2)  Identify  bat  proteins  interacting  with  effector  “hits”  from  our  arbovirus  rescue  assays;;  and  3)  Determine  which  bat  host  factors  interacting  with  effector  protein  hits  affect  viral  replication.  Our  long-­term  goal  is  to  use  this  model  system  to  define the key bat innate immune mechanisms that restrict arbovirus replication.