并用NADH和NADPH生物转化甘油制备1,3-丙二醇的合成生物系统研究
批准号:
21076172
项目类别:
面上项目
资助金额:
36.0 万元
负责人:
方柏山
依托单位:
学科分类:
B0812.生物化工与合成生物工程
结题年份:
2013
批准年份:
2010
项目状态:
已结题
项目参与者:
余劲聪、王兆守、王世珍、彭雅娟、李红春、朱春杰、韩建峰、彭江海、胡译丹
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中文摘要
单一辅酶有限还原力已成为生物法转化甘油生产1,3-丙二醇的瓶颈,通过扩展可利用的辅酶资源可以提高转化效率。为了实现NADH和NADPH两种辅酶的优化并用,本课题研究具有不同辅酶依赖特性的1,3-丙二醇氧化还原酶及其它甘油代谢关键酶的分子改造、不同辅酶依赖性的1,3-丙二醇氧化还原酶的并用和1,3-丙二醇合成生物系统地构建与运作。首先,运用蛋白质虚拟定点突变和饱和突变工具,结合基于序列的氧化还原酶辅酶依赖型自动判别模型,力求实现此类新酶的高通量筛选,并为研究辅酶依赖特性的分子基础问题提供新的思路和方法;其次,基于合成生物学的高效技术体系,标准化甘油代谢途径的关键酶,分别构建有关元件库、基因环路装置库及具有不同并用辅酶特性的合成生物系统,实现1,3-丙二醇的高效生产,并为探讨辅酶并用机制提供新的生物砖和数据。其研究成功,可为其他生物化学品合成生物法生产开辟先河和提供科学依据。
英文摘要
本文利用新兴的合成生物学方法,构建了编码基因分别为dhaT基因和yqhD基因的两类生物砖元件,可相应地表达出依赖于辅酶NADH和NADPH的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)及其同工酶(YQHD)。在此基础上,研究了不同生物转元件的表达效率,并对1,3-丙二醇氧化还原酶最优培养条件和酶活性质进行探讨。然后,研究甘油脱氢酶基因gldA的克隆与表达;融合酶基因yqhD-gldA的构建与表达;甘油脱水酶基因dhaB的克隆;NADH氧化酶基因表达的突变菌株构建;构建诱导裂解回路释放重组蛋白和用于1,3-丙二醇发酵的菌株代谢进化。.主要内容和结果如下:(1)构建了分别编码1,3-丙二醇氧化还原酶PDOR及其同工酶YQHD的基因dhaT和yqhD的生物砖元件库。dhaT与yqhD基因分别源自Klebsiella pneumoniae和E. coli,通过PCR扩增,并将其标准化。根据生物砖标准组装方法依次将RBS、T7 promoter、TT terminator与目的基因dhaT和 yqhD连接,构建成具有不同表达效率(RBS1.0、RBS0.6、RBS0.3、RBS0.07)的生物砖1,3-丙二醇氧化还原酶及其同工酶库;(2)考察了pSB1A2-T7-RBS-dhaT-TT蛋白表达系统的表达条件。与优化前的酶活力相比,基于RBS1.0的酶活力显著提高,粗酶活由52 U/ml提高到211 U/ml,比活由12.1 U/mg提高到40.3 U/mg,高于现有文献报道值;(3)考察了1,3-丙二醇氧化还原酶无细胞抽提液的酶学性质。结果表明该酶的最适宜环境为45 ℃,pH 11.0,且该酶在此条件下具备一定稳定性。考察发现Mn2+对酶有极强的激活作用和该酶只对1,3-丙二醇表现出活性;(4)成功地实现甘油脱氢酶基因gldA的克隆与表达;(5 )成功地实现融合酶基因yqhD-gldA的构建与表达,其中甘油脱氢酶为NAD、NADP兼用型;(6)成功地实现甘油脱水酶基因dhaB的克隆;(7)成功地实现NADH氧化酶基因表达的突变菌株构建;(8)构建诱导裂解回路释放重组蛋白。我们利用标准化生物砖,构建了1,3-丙二醇氧化还原酶诱导表达的lysis裂解回路,在L-阿拉伯糖诱导下,实现了细胞诱导裂解释放重组蛋白;(9)成功地实现用于1,3-丙二醇发酵的菌株代谢进化。
期刊论文列表
专著列表
科研奖励列表
会议论文列表
专利列表
DOI:10.1002/elsc.201200106
发表时间:2013-07
期刊:Engineering in Life Sciences
影响因子:2.7
作者:Chunjie Zhu;Bin Chen;B. Fang
通讯作者:Chunjie Zhu;Bin Chen;B. Fang
Central Carbon Metabolism in Marine Bacteria Examined with a Simplified Assay for Dehydrogenases
使用简化的脱氢酶检测方法检查海洋细菌的中心碳代谢
DOI:10.1007/s12010-013-0200-8
发表时间:2013-04
期刊:Applied Biochemistry and Biotechnology
影响因子:3
作者:Wen, Weiwei;Wang, Shizhen;Zhou, Xiaofen;Fang, Baishan
通讯作者:Fang, Baishan
DOI:--
发表时间:2011
期刊:计算机与应用化学
影响因子:--
作者:余劲聪;方柏山
通讯作者:方柏山
DOI:10.1007/s12257-013-0125-7
发表时间:2013-08
期刊:Biotechnology and Bioprocess Engineering
影响因子:3.2
作者:Shizhen Wang;Jing Wang;Xiaofen Zhou;Yingxia Guo;B. Fang
通讯作者:Shizhen Wang;Jing Wang;Xiaofen Zhou;Yingxia Guo;B. Fang
DOI:--
发表时间:2011
期刊:中国科学:化学
影响因子:--
作者:王兆守;彭江海;胡译丹;方柏山
通讯作者:方柏山
高性能AiiA酶的机器学习筛选和催化机制探究
- 批准号:--
- 项目类别:面上项目
- 资助金额:54万元
- 批准年份:2022
- 负责人:方柏山
- 依托单位:
NAD(P)H依赖型氧化还原酶的导电性和催化新机理研究
- 批准号:21978245
- 项目类别:面上项目
- 资助金额:66.0万元
- 批准年份:2019
- 负责人:方柏山
- 依托单位:
多酶生物分子机器的可控组装与制备药物的生物化工基础
- 批准号:21336009
- 项目类别:重点项目
- 资助金额:300.0万元
- 批准年份:2013
- 负责人:方柏山
- 依托单位:
深海细菌Pseudomonas marincola的氧化还原酶高通量挖掘、特异性研究与应用
- 批准号:41176111
- 项目类别:面上项目
- 资助金额:69.0万元
- 批准年份:2011
- 负责人:方柏山
- 依托单位:
国内基金
海外基金















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