Ki67启动子调控的荷载双基因RNA干扰的条件增殖腺病毒靶向治疗肾癌研究

本课题从构建Ki67-ZXC2、Ki67-ZXC2-Ki67siRNA、Ki67-ZXC2-hTERTsiRNA、Ki67-ZXC2-double-siRNA质粒开始，包装成病毒，然后通过PCR和基因测序的方法鉴定质粒构建正确，病毒能够有效表达目的基因达到沉默目的基因的作用。先后做了体外和动物实验。体外实验用了这4种病毒分别感染不同的肾癌细胞Ketr-3，786-O，ACHN和正常人肾小管上皮细胞HK-2，通过病毒复制能力检测发现这4种病毒可以在肿瘤细胞中复制，通过PCR和免疫组化的方法检测发现目的基因能够被有效沉默，且细胞毒性实验也证明了这4种病毒对肿瘤细胞的毒性作用在MOI=100时，48h能够将其全部杀死，而对HK-2细胞在各个滴度毒性作用均很弱，且4种病毒可以有效抑制肿瘤细胞的生长，MOI=100时，48h抑制率都超过了50%。DAB染色法也发现分别感染这4种病毒后早期和晚期凋亡实验发现Ki67-ZXC2-double-siRNA的抑制凋亡作用最强，Ki67-ZXC2-Ki67 siRNA和Ki67-ZXC2-hTERT siRNA其次，Ki67-ZXC2的抑瘤作用最弱。动物实验采用裸鼠皮下接种Ketr-3造模后，分别在各组小鼠瘤内注射这4种病毒，发现Ki67-ZXC2-double-siRNA能够有效抑制肿瘤生长，免疫组化显示病毒能够有效抑制组织中携带的目的基因的表达的蛋白水平，HE染色发现Ki67-ZXC2-double-siRNA抑制肿瘤生长能力最强，TUNEL法也显示Ki67-ZXC2-double-siRNA组促进肿瘤凋亡能力最强，HE染色法对肝脏检测，发现这4种病毒对肝脏的毒性均很弱，说明了病毒的肿瘤靶向性和对其他脏器的安全性。.结论：Ki67启动子能够使得病毒靶向在肿瘤细胞内增殖，且体外和动物实验均证明了Ki67-ZXC2-double-siRNA对肿瘤的抑制能力明显的强于Ki67-ZXC2-Ki67 siRNA和Ki67-ZXC2-hTERT siRNA组，强于Ki67-ZXC2组，且对肝脏的损害较小。