cullin 2调控环路对HPV16 E7介导的宫颈癌发生发展的促进作用及分子机制

Cervical cancer is a common malignancy of women worldwide. High-risk human papillomavirus (HR-HPV) infection is a necessary factor in the development of cervical cancer. Clarifing the interaction between virus oncoproteins and host cell signaling pathway promotes to explore new strategies of target therapy. In this research program, we focus on the cellular protein cul2, which is specifically binds with HPV16 E7. We propose that, in HR-HPV E7-induced carcinogenic process, there exist "miR-424/cul2/E2F1/miR-424" regulatory feedback loop(also as cul2 regulation loop), based on varoius investigations such as molecular, cellular, clinical data and animal models, and through a variety of molecular bioligy techniques,such as co-IP, pull-down, ChIP and luciferase report assay.We verify that sustained overexpression of cul2 caused by cul2 feedback loop promotes the development of HPV16-induced cervical cancer. The aim of this study is to reveal a new mechanism for the development of cervical cancer, and to provide experimental evidence for exploring new target therapy.

宫颈癌是迄今严重威胁妇女的常见恶性肿瘤，高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染是宫颈癌发生发展的必需因素。阐明病毒癌蛋白与宿主细胞信号通路间的相互作用对探寻宫颈癌防治新靶点有重大意义。本项目以与HPV16 E7特异性结合的宿主蛋白cullin2 (cul2)为切入点，提出在HR-HPV E7致癌促癌过程中存在"miR-424/cul2/E2F1/miR-424"反馈性调控环路（简称cul2调控环路）的假设，并拟通过细胞、动物模型和组织标本，利用免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因检测等多种分子生物学技术，依次观察miR-424对cul2、cul2对E2F1、E2F1对miR-424的调控作用、及其整个调控环路对E7功能的影响，验证由cul2调控环路引起的cul2持续过表达在HPV16介导的宫颈癌发生发展过程中的作用。旨在揭示宫颈癌发生发展的新机制和为探寻宫颈癌防治新靶点提供实验依据

人乳头瘤病毒癌蛋白E7在宫颈癌的发生过程中起着关键致癌作用。 最近的研究表明CUL2参与了HPV16，而非其他基因型别，癌蛋白E7介导的pRb降解。 因此，在HPV16诱导的宫颈癌发生过程中，CUL2可能发挥了独特的作用。考虑到HPV16的强致癌性，探讨CUL2本身在HPV16诱导的宫颈癌中的表达，相关调节机制和致癌潜力具有潜在临床价值。我们首先发现宫颈癌细胞高表达miR-424能够抑制cul2的表达，预测软件发现miR-424能够直接靶向cul2 3’UTR，双荧光素酶报告基因检测证实cul2是miR-424的直接靶基因，cul2表达质粒和miR-424共转染能够逆转miR-424的抑制肿瘤细胞生长作用。对cul2的功能探索发现抑制宫颈癌细胞cul2的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖，引起细胞周期G1/S期阻滞并促进肿瘤细胞发生早期凋亡。裸鼠移植瘤实验也发现宫颈癌细胞SiHa稳定低表达cul2较对照组细胞成瘤能力减弱，移植瘤生长速度减慢。进一步研究发现cul2不仅是miR-424的下游分子，抑制cul2的表达也能够反馈上调miR-424的表达，而cul2高表达能够抑制miR-424的表达。深入探索发现miR-424转录起始位点上游2000bp内存在2个E2F1的识别位点，荧光素酶报告基因检测和染色质免疫共沉淀均证实E2F1对miR-424的直接调控。而我们发现cul2能够正向调控E2F1的表达，免疫共沉淀和pull-down实验结果均显示cul2能够与E2F1结合。因此，我们的研究发现了miR-424/ cul2/E2F1/miR-424调控环路的存在。另外，我们发现HPV16 E7而非HPV18 E7能够特异性结合cul2。与HPV阴性宫颈正常组织相比，cul2、E2F1和HPV16 E7均在单纯HPV16阳性的宫颈正常组织、CIN2-3和宫颈癌组织中表达逐渐增高，而miR-424的表达则逐渐下降，与cul2、E2F1和HPV16 E7的表达呈显著负相关。我们的研究阐释了由cul2调控环路引起的cul2持续过表达在HPV16介导的宫颈癌发生发展过程中的作用，揭示宫颈癌发生发展的新机制，并为探寻宫颈癌防治新靶点提供实验证据。本项目按要求完成，发表高质量SCI论文3篇，参加国际学术交流2次，其中进行大会发言1次，培养博士研究生1名，并资助研究团队成员赴美国进行交流访问。

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