高三尖杉酯碱对AML作用的靶点筛选及联合阿克拉霉素的协同作用分子机制研究

我们以往的研究发现以高三尖杉酯碱、阿克拉霉素、阿糖胞苷组成的联合方案治疗急性髓细胞白血病具有较高完全缓解率和总体生存率。为了证实高三尖杉酯碱（HHT）与阿克拉霉素（ACR）是否具有协同作用及作用的机制，我们在白血病体外及体内实验发现两药在抑制白血病细胞增殖、凋亡方面均具有协同作用。我们的研究发现HHT可能抑制AML细胞的PI3K/AKT信号并间接抑制WNT/β-catenin信号而杀伤AML细胞，ACR可能通过抑制AML细胞的WNT/β-catenin信号而杀伤AML细胞。两药联合可能通过同时抑制PI3K/AKT及WNT/β-catenin信号而协同杀伤AML细胞。但这些研究不能回答HHT的直接作用靶蛋白。. 为寻找HHT直接作用的靶蛋白，我们采用化学合成的方法合成出带上生物素标记的高三尖杉酯碱药物，利用链亲和素与生物素之间的高度亲和作用，将高三尖杉酯碱-生物素的合成化合物与链亲和素连接，形成高三尖杉酯碱-生物素-链亲和素的耦合，从而将药物固定在琼脂糖树脂柱上，为接下来寻找高三尖杉酯碱的作用靶蛋白的研究工作提供了一种方便有效的工具，这也是本试验研究方法中具有创新意义的重要步骤。并且，借由该亲和柱以及蛋白纯化和蛋白质谱技术，我们最终发现了高三尖杉酯碱作用白血病细胞时结合的直接靶蛋白为Myosin 9（又称NMHC-IIA）。我们还通过构建NMHC IIA高表达稳转细胞株、表达谱基因芯片分析、western blot和real-time PCR等方法对高三尖杉酯碱作用的可能分子机制进行探讨，结果表明高三尖杉酯碱能够通过结合并上调NMHC IIA蛋白，对细胞周期和MAPK通路上的多个成员产生影响，最终引起白血病细胞系周期发生改变并最终诱导细胞凋亡的发生。