稳定性同位素示踪环境微生物核酸DNA的方法研究

DNA-based stable isotope probing (DNA-SIP) is a technique that is used link the functional processes with the identity of activie microbial communities that grow on the 13C-labeled substrates in complex encironment. DNA-SIP is one of the most powerful techniques in microbial ecology and biotechnology. Currently, however, DNA-SIP technology is still at the stage of qualitative descriptions. The effective separation of 13C-DNA from 12C-DNA, quantitative determination of the labeled degree of heavy DNA (putative 13C-DNA), and 13C-DNA downstream analysis of DNA-SIP are still the main obstacles for its wide application. This project is intended to systematically evaluate the key technical parameters of the DNA-SIP technique, such as detection limitation of 13C-DNA, separation distance of 13C-DNA from 12C-DNA, recovery quality of 13C-DNA and the parameters for the whole genome amplification of 13C-DNA, with emphasis on microbial DNA from both pure culture and complex environment systems, and to elucidate the feasibility of 13C-DNA downstream analysis by using new-generation pyrosequencing techniques.The key parameters identified will be further verified by stable isotoping the active methanotrophs in the Chinese typical paddy soil. Overall, this project is intended to establish the quantiative evaluation system for the key technical parameters of DNA-SIP, and the results of this project is expected to greatly promote the application of DNA-SIP in the different research areas.

稳定性同位素示踪环境微生物核酸DNA的方法简称DNA-SIP，是指采用稳定性同位素13C-标记复杂环境中特定功能微生物的核酸DNA，并对13C-DNA进行下游分析鉴别复杂环境中微生物作用者的先进技术。然而，目前DNA-SIP技术仍处于一种定性的描述阶段，有效分离13C-DNA、定量判定13C-标记程度及其下游分析仍是DNA-SIP的主要技术难点。本项目拟针对纯菌DNA和复杂土壤环境微生物群落DNA体系，系统评价DNA-SIP的关键技术指标，包括13C-DNA检测限、13C-DNA与12C-DNA分离距离、13C-DNA回收质量、微量13C-DNA的全基因组扩增效率等主要技术参数，进一步研究新一代高通量测序技术在13C-DNA下游分析中的应用，结合我国典型土壤甲烷氧化过程的DNA-SIP技术研究，建立DNA-SIP主要技术指标的评价体系，为DNA-SIP在不同研究领域的应用提供重要技术参考。

DNA-SIP是研究复杂环境中重要活性微生物的新兴手段，是指采用稳定同位素13C-标记复杂环境中特定功能微生物的核酸DNA，并对13C-DNA进行下游分析鉴别复杂环境中微生物作用者的先进技术。本项目针对复杂土壤环境微生物群落DNA -SIP的主要技术难点，系统优化了一些关键技术指标，提升了基因组DNA的纯度（关键纯度指标从A260/230≈0.3，A260/280≈1.5提升至A260/230≈2.0，A260/280≈1.8）、初步解决了微量13C-DNA的全基因组扩增效率低、偏好性大的难题，并进一步拓展了新一代高通量测序技术在13C-DNA下游分析中的应用，结合我国典型水稻土甲烷氧化及氨氧化过程的DNA-SIP技术研究，初步建立了DNA-SIP主要技术指标的评价体系，关于高通量测序与稳定性同位素的技术耦合成果，2013年发表于《微生物学报》后，在当年度所有246篇论文中，被引和被下载分别排名第5和第2，表明项目成果得到国内同行高度关注，显著推动了稳定性同位素示踪环境微生物核酸DNA-SIP技术的影响和应用。同时利用高通量测序技术，将13C-DNA检测限提高了至少上百倍，发现了传统甲烷氧化菌在复杂土壤环境中具有新的功能，能够氧化极低浓度2.7nM的大气甲烷，远远低于纯培养条件下的800nM生长阈值，这一成果2016年度被Nature Communications报道。自2013年项目实施以来，相关技术成果得到国际同行重视，已经协助荷兰、德国、葡萄牙和奥地利同行发表SCI论文4篇，其中一篇发表在国际微生物生态学会刊The ISME Jounral（IF=9.328）。2016年8月项目负责人联合美国科学院院士James Tiedje和瑞士Martin Hartmann教授，在国际微生物生态学大会上组织了圆桌会议专题：土壤微生物：大数据解析（Soil Metagenomics: deciphering big data），重点介绍了项目关于稳定性同位素核酸探针DNA-SIP在土壤、海洋和地质生物学研究中的应用，得到了国内外同行的热烈反响。

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