黑质KCC2/NKCC1参与肝性脑病诱致运动障碍及其机制

最近研究显示中枢神经系统内不同部位的氯稳态失衡参与多种神经功能紊乱，然而其在肝性脑病中的作用尚不清楚。本研究深入探讨肝性脑病状态下黑质网状部SNr内氯离子稳态失衡情况及可能的分子机制，以期从新的角度阐明HE的中枢发病机制、为寻找有效的HE临床治疗手段提供实验室依据。需要说明的是，本研究使用谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）67-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）转基因小鼠。GAD67是GABA合成限速酶，在该基因敲入小鼠内，GAD67的启动子受GFP基因调控，因此，所有中枢神经系统内GABA能神经元均被绿色荧光蛋白所标记，该特点能够很好地解决传统染色方法无法清晰、准确地标记GABA能神经元这一关键问题。观察运动迟缓的HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度的改变及与氯稳态相关的两种主要的基因KCC2和NKCC1的表达变化情况。评估使用KCC2和NKCC1特异性抑制剂对小鼠运动能力的影响。利用实时定量反转录聚合酶链反应检测36名患有Ⅲ-Ⅳ期HE的肝硬化患者、20名尚未罹患HE的肝硬化患者及健康对照组的KCC2和NKCC1的mRNA水平。使用2∆∆CT 方法计算表达情况。氯离子成像结果显示HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度升高。此外，KCC2在mRNA及蛋白水平的表达都下降，在神经元细胞膜处的表达下降尤为明显；与此相反，NKCC1的表达没有明显变化。阻断正常小鼠KCC2可导致运动能力的下降，在肝毒性小鼠可导致运动迟缓进一步加剧。相反，在肝功能衰竭小鼠阻断NKCC1并不能使其运动能力恢复正常。患有HE的肝硬化患者KCC2 mRNA的水平与尚未罹患HE的肝硬化患者及健康对照组相比明显下降。然而，NKCC1 mRNA水平在各组之间无明显差异性。此外，患有HE的肝硬化患者的KCC2 mRNA水平与Child-Pugh评分及血氨水平呈负相关，与Glasgow昏迷评分呈正相关。研究表明氯稳态失衡可能是HE导致的运动迟缓的病理生理学基础，旨在恢复氯稳态的相关药物可能成为治疗肝功能衰竭的潜在性选择。研究表明KCC2和NKCC1的表达失衡可能成为预测HE的信号。