内质网应激在乙型肝炎-肝硬化-肝癌转化过程中的调节机制及相关药物作用靶分子筛选

1. 人肝脏组织的蛋白组学研究共鉴定蛋白质3130个，其中有定量信息的蛋白质2704个，各组间一半以上的蛋白有显著性差异。2. 肝炎/肝癌组织中ER应激相关蛋白的表达：BIP在肝炎-肝癌各个阶段表达量均有差异，在肝炎和肝癌时表达显著增加。ER应激蛋白MANF在肝炎-肝癌各个阶段表达量均有差异；在腺癌组织中的表达增加，而肝细胞癌（HCC）组织中表达减少；慢乙肝中MANF 的表达也增加。Hrd1是ER膜定位的泛素连接酶，在HBV感染的早期，Hrd1的表达明显下降，在随着疾病的进展，Hrd1的表达增加。CHOP在肝炎和肝癌细胞中表达明显增加，且定位发生改变。UPR通路基因XBP1、PERK、ATF6、IRE1等在肝肝炎和癌中表达明显增加。3. MANF对肝细胞癌的抑制作用：对150例肝癌和136例癌旁对照研究发现，在肝癌中MANF的mRNA和蛋白水平均低表达。高表达MANF的病人5年生存期明显延长，且MANF对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭均有抑制作用。将携带MANF shRNA干扰片段的慢病毒载体稳定转染人肝癌细胞并接种裸鼠，然后再瘤内注射重组人MANF蛋白，观察MANF对肿瘤生长的影响。结果显示MANF敲低促进肿瘤形成和生长，而重组MANF蛋白明显抑制肿瘤生长。条件性MANF敲除鼠与肝脏cre鼠交配产生肝细胞特异性MANF敲除小鼠，然后诱导肝癌。目前已经产生了F1杂交鼠。4. MANF抑制肝癌的机制：肝癌细胞中MANF与p65在核内共定位，而低分化肝细胞癌中MANF与p65在胞浆共定位。ER应激可促进MANF和p65在核内相互作用，并抑制p65与DNA结合，从而抑制NF-κB下游基因表达。MANF、p65、SUMO1或SUMO2/3在核内能形成p65-MANF-SUMO复合物。SUMO1能增加缺氧诱导的MANF和p65入核，SUMO2/3能稳定MANF和p65表达，提示SUMO化修饰能调节MANF和p65的相互作用，从而参与调控NF-κB通路。MANF和RNF2有直接相互作用，且RNF2与MANF在核内共定位。MANF可剂量依赖性的上调RNF2表达，而RNF2不影响MANF转录。提示RNF2与MANF的相互作用仅发生在蛋白水平。42%的HCC呈现MANF低表达和Hrd1高表达，这种负相关有显著性差异。Hrd1可调节MANF水平，提示MANF水平降低可能与Hrd1激活有关。