基于NAD(H)系统改造与调控的产丁二酸大肠杆菌代谢工程研究

还原性终端产物丁二酸是重要的C4平台化合物，系统还原力的强弱是其合成效率的重要影响因素，而NAD(H)总量及NADH/NAD+比例是调节还原力的分子基础。本课题采用基因工程改造与发酵调控相结合的手段，提高菌株胞内的NAD(H)总量并维持适宜菌株生长与产物合成的NADH/NAD+比例，从而大幅度提高丁二酸的合成效率。首先，考察了在不同还原性碳源、不同氧化还原电位值等条件下，NAD(H)的合成及分解代谢途径相关酶的转录水平和蛋白水平的变化规律，揭示了引起NAD(H)总量及NADH/NAD+比例变化的分子机制。其次，利用分子生物学手段，调控表达NAD(H)合成途径中的一个或多个基因，以有效提高菌株胞内的NAD(H)总量，并考察其对菌株胞内NADH/NAD+比例的影响，利用代谢分析手段考察分子改造对于菌株产物分布、产物生成速率等影响以反馈指导上述生产菌的构建工作，最终获得系列生产性能优异的改造菌株。此外，进一步结合利用氧化还原电位调控等发酵调控手段提高NAD(H)总量并调节胞内NADH/NAD+比例至适宜值，为丁二酸的合成提供优良的系统还原力条件，大幅度提高丁二酸的合成效率。本课题实施过程中共发表论文34篇，其中SCI 收录17篇，申请发明专利5项，其中5项授权，共培养课题相关博士后1名，硕博士研究生10名。本课题超额完成各项研究任务及指标，综合利用基因工程与发酵调控手段，采用胞内胞外共调节辅酶的方法，实现了微观与宏观两种调控手段的合理结合，确定了基于NAD(H)调控丁二酸高收率、高生产强度的生物合成策略，为建立厌氧发酵制备还原性产物的柔性平台技术打下良好的基础。