AMPKα1及信号调节介导新鲜冰冻血浆保护休克后血管内皮细胞损伤的机制研究

基于新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma, FFP )的复苏液能大幅度提高失血性休克(HS)患者治疗疗效，但机理尚不清楚。我们前期工作发现FFP显著上调AMPKα1磷酸化和抑制缺氧诱导人肺微血管内皮细胞HPMEC及HS大鼠肾等血管通透性和凋亡，提示AMPKα1磷酸化可能介导FFP抑制血管通透性和凋亡参与血管内皮细胞保护。本项目拟在前期研究基础上，利用已有HPMEC和已建立HS大鼠等模型，阻断或下调AMPKα1磷酸化，确定AMPKα1磷酸化介导FFP抑制HS导致血管通透性和细胞凋亡；进一步分别改变内皮细胞AMPKα1信号关键分子Sirt1 和FoxO1活性，探讨俩分子是如何与AMPKα1相互作用介导FFP内皮细胞保护作用。项目不仅有助于揭示FFP保护内皮细胞作用机制，而且能为研发抑制血管通透性和细胞凋亡FFP替代品或新药提供科学依据。

失血性休克(HS)因其诱导血管收缩、增加微血管通透性及细胞凋亡等往往引起肺、肾等多器官功能不全。新鲜冰冻血浆（FFP）能大幅度地提高疗效。前期发现FFP复苏能抑制缺氧诱导人肺微血管内皮细胞及HS鼠肾血管通透性及凋亡，提示FFP可能参与降低HS导致血管高通透性和细胞凋亡，修复内皮屏障、维护其功能完整过程，然而机制不清楚。项目以腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)为切入点，利用人肺微血管内皮细胞和HS小鼠等模型，下调HS小鼠中AMPKα1活性，检测FFP复苏后小鼠肾、肺等主要脏器血管通透性、细胞凋亡及相关蛋白表达，结果显示FFP复苏降低HS小鼠肺血管通透性，减少HS鼠肾血管内皮细胞的凋亡，下调AMPKa活性后肺血管通透性增加，连接蛋白表达降低，肾血管内皮细胞的凋亡增加，凋亡相关酶Caspase-3蛋白裂解片段增多且这些与AMPKα1磷酸化有关。表明AMPKa在这一过程中发挥重要作用。为进一步确定AMPKα1特异性位点磷酸化在FFP内皮细胞保护中的作用， 将含有AMPKα1特异性位点磷酸化质粒转染细胞，结果发现恢复AMPKα1活性能显著提高FFP降低缺氧/再复氧诱导其通透性及凋亡，说明AMPKα1特异性位点磷酸化介导FFP内皮细胞保护作用。为证实FFP中激活AMPKα1关键因子脂联素参与FFP内皮细胞保护作用。分别采用FFP或脂联素抗体亲和层析柱耗竭脂联素的FFP或向耗竭脂联素又重新添加人工合成脂联素FFP复苏，检测休克后各组小鼠肺等组织中AMPKα1活性、血管通透性、细胞凋亡及相关蛋白表达， 结果发现FFP中脂联素是激活AMPKα1参与内皮细胞的保护关键因子。另外下调AMPKα1活性，发现FFP复苏HS小鼠肾或肺组织或内皮细胞Sirt1表达降低，而抑制Sirt1却可降低AMPKα1磷酸化，削弱FFP复苏抑制细胞通透性。说明AMPKα1与Sirt1之间相互调节介导FFP内皮细胞保护作用。同样发现HS可导致小鼠肺组织AMPKα1和FoxO1两蛋白磷酸化下调，FFP复苏却能逆转。进一步发现这些与FFP能活化胞内FoxO1磷酸化，FoxO1 出核增加及FoxO1从其DNA结合转录区分离，导致FoxO1转录活性降低，下调AMPKα1活性可阻碍FFP上述作用， 表明FFP可通过激活AMPKα1增加FoxO1磷酸化降低其转录活性抑制内皮细胞通透性参与内皮细胞保护功能。

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