基于二次谐波和双光子激发荧光成像的肌原纤维重构过程研究

心脏的工作状态与肌原纤维的结构和功能密切相关，例如，在心脏发育过程中，肌原纤维的数目同时在横向和纵向增加，而在成人心脏中，过压状态下单个心肌细胞内表现为肌原纤维在横向增加肌节数目；过容状态下单个心肌细胞内表现为肌原纤维在纵向增加肌节数目。在正常生理条件下（如锻炼和怀孕），过容或过压会促进心脏功能加强；但在病理状态下，肌原纤维的重构会被引向心脏衰竭。目前，人们尚不了解为什么肌原纤维的应急重构无法满足负载的变化最终导致心衰，因此研究肌原纤维的成分合成、结构组合及在生理或病理环境下的应激重构机理一直是生物医学领域中的重要课题。.以往研究中，主要采用荧光染色技术，在荧光显微镜下观察肌节的形成与发展。但存在两个缺点：在细胞培养模型方面，采用二维片状培养模型，细胞在两天内将退分化为球状，然后再分化为片状，与实际三维定向分布的肌原纤维在结构和功能上都有巨大的区别，不能用于模拟生理状态。在光学成像方法方面，细胞固定过程会破坏肌原纤维的结构，而且只能对细胞发展过程中的几个预定时刻进行观测，无法得到连续的动态信息。.在细胞培养模型方面，我们提出并建立了基于细胞排列的类在体的鼠心肌细胞排列培养模型。利用PDMS制作了具有多通道阵列的生物芯片，利用光镊将细胞排列在通道中，放入在线培养器培养，实现了鼠心肌细胞排列培养，并实现了在线拉伸/电刺激。首次在线观测到了正在生长的鼠心肌细胞的细胞膜和肌原纤维的动态位置关系，并观测到肌节的插入和成长过程，通过对大量心肌细胞的多区域肌节添加的成像过程记录和分析，提出了准肌原纤维模型的补充和发展模型。首次记录到拉伸条件下肌节添加过程，我们发现：在纵向拉伸条件下，肌节添加发生在肌节的末端，并且以原有的肌原纤维为模板；在横向拉伸条件下，A-带先破坏，然后一个肌原纤维分裂成两个。.在成像方法方面，我们提出并发展了基于声光扫描器（AOD）和空间光调制器（SLM）的高速多焦点双光子激发荧光（TPEF）显微成像、可寻址的多焦点二次谐波显微（SHG）成像、一维扫描线的多区域TPEF显微成像、基于声光扫描器的可寻址的荧光寿命显微成像等技术，并建立了基于脉冲分束器的TPEF/SHG复合显微成像和心肌细胞在线培养系统，实现了快速、目标区域选择的结构和功能成像，为活细胞成像提供了重要手段。