油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB不育基因Bnms3的功能分析

油菜隐性细胞核雄性不育系9012A的雄性育性受两个位点调控，分别是恢复基因位点BnMs3/Bnms3及复等位位点BnRf（包含3个复等位基因型BnRfa，BnRfb和BnRfc）。本研究在前期将BnMs3位点定位在C9染色体上一个约9.7 kb的物理区段内，包含3个候选基因。转基因互补实验证明，与拟南芥TIC40高度同源的ORF1能够完全恢复9012A的雄性不育，是BnMs3的目标基因。该基因命名为BnaC9.TIC40。序列分析发现，9012A中的BnaC9.TIC40是由于A10和C9染色体的非同源重组产生的，而临保系（TAM）中的Bnms3位点则是由于BnaC9.TIC40在编码区的一个2-bp的InDel而导致的蛋白提前终止所致。BnaC9.TIC40在油菜中组成性表达，其产物被定位于质体内。酵母双杂交发现BnaC9.TIC40和油菜中的TIC110-1成员之间存在互作，暗示着该基因的可能存在和拟南芥TIC40同样保守的功能。但是，在不育基因BnRfb缺失的前提下，BnaC9.TIC40的功能缺失突变仍然表现为雄性可育的表型，表明BnaC9.TIC40相比拟南芥TIC40进化出育性发育调控相关的功能。.为了进一步揭示9012A的雄性不育机理，利用图位克隆的方法成功的从一个约60 kb的大插入片段中，成功的分离到不育基因BnRfb。该基因是由三个拟南芥来源的基因融合而成的嵌合基因，其主要的部分是和拟南芥的mtHSP70-1高度同源，因而将其命名为BnA7.mtHSP70-1-like。序列分析发现，该基因同时存在于不育系和恢复系中（在启动子区存在两个InDel），而在临保系中完全缺失。拟南芥的遗传转化证明，来源于恢复系和不育系的BnRfb均能够导致拟南芥的完全雄性不育，其表型和油菜核不育系9012A的表型高度一致。因此，BnRfa应该对应于60 kb的插入片段内一个和BnRfb紧密连锁的基因。BnA7.mtHSP70-1-like在减数分裂到四分体时期的绒毡层和雄配子中表达量最高。与恢复基因BnMs3不同，BnA7.mtHSP70-1-like编码的长度为1386-aa的蛋白定位于细胞核。酵母双杂交显示，BnaC9.TIC40和BnA7.mtHSP70-1-like并不存在直接的互作。因此，上述两个基因介导着一条新的的调控雄性育性的路径。