细粒棘球绦虫Eg95抗原T-B联合表位鉴定及其MAP疫苗免疫保护性研究

新疆是我国包虫病高发区之一，研制有效的控制包虫病流行新型疫苗是促进西部牧区经济发展的迫切需要。本课题我们预测细粒棘球绦虫Eg95抗原的T-B联合表位，使用在线预测软件结合多种参数综合预测Eg95抗原的B和T细胞表位、二、三级结构、跨膜区域，最终确定三个T-B细胞联合表位的氨基酸区域和相应的编码基因，设计相应引物分别扩增各段T-B细胞联合表位的氨基酸序列，连接到PMD18-T载体上，测序后将正确的序列扩增，用T4连接酶将各段外源基因重组到M13KE噬菌体载体上，构建成功的M13KE/Eg95-1、M13KE/Eg95-2与Eg95-3质粒转入感受态细胞中，运用PCR方法对插入序列进行初步鉴定，测序确定序列正确且无基因突变。使各段基因所对应的外源肽融合表达于M13KE噬菌体蛋白上，提纯重组噬菌体，SDS-PAGE鉴定目的重组PIII蛋白表达水平。SDS-PAGE检测表明三个T-B表位肽段的融合PIII蛋白均得到成功表达。Western blot结果显示rEg95抗血清和细粒棘球蚴病患者血清均能识别3个T-B表位，ELISA检测表位Eg95-2和Eg95-3的信号强度在兔抗rEg95血清和病人血清中的反应均较强, 具有良好的抗原性，最终筛选并确定抗原性较强的表位短肽Eg95-2和Eg95-3作为细粒棘球蚴病多表位疫苗的候选表位。Eg95-2和Eg95-3表位短肽免疫小鼠，ELISA检测不同抗原表位诱导Th1型或Th2型细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10）水平，发现Eg95-2和Eg95-3 T-B联合表位短肽均能诱导Th1型免疫应答。用Eg95-2和Eg95-3 T-B联合表位短肽和Poly-Asp-Lys交联制备MAP交联物，将Th1型T-B联合表位MAP交联体免疫小鼠，原头蚴腹腔接种小鼠感染，在感染后2周和4周检测MAP交联体对棘球蚴感染小鼠的免疫保护效果，发现特异性抗体IgM和IgG效价较高，Th1型细胞因子（IL-2和IFN-γ）水平明细高于Th2型细胞因子（IL-4、IL-5和IL-10）水平，初步构建了Eg95-2和Eg95-3 T-B联合表位MAP疫苗，可应用于细粒棘球蚴病多表位肽疫苗研制，为研究控制包虫病的有效疫苗奠定了基础。