数字化单分子电化学定量分析及其在复杂样品病原体高灵敏检测中的应用

The exploration of nature and life has reached to the lever of single cell and single molecule. Accurate and sensitive detection of single molecule, especially single DNA or protein biomolecule, would bring some new breakthroughs in biology and medicine. Single molecular fluorescence detection methods and techniques have been well developed and widely used. While single molecular electrochemical detection started relatively later and now focuses on the development of methodology and basic theory. Single molecular electrochemical quantitative analysis and its application in the complex systems are still challenge. This project aims to develop high effective electrochemical signal amplification strategy based on the catalytic property of enzyme and nanozyme to realize high sensitive electrochemical detection at single molecular lever, to establish a set of digital single molecular electrochemical quantitative detection methods, and to realized their application for high sensitivity detection of virus in the complex systems. The digital analysis strategy will be integrated with the high sensitive electrochemical detection method and used to resolve the problems of signal fluctuation and reliability on single molecular electrochemical detection. And microelectrode array and droplet microfluidic will be used to overcome the technical difficulty of high throughput electrochemical detection. This study will promote the application of single molecule electrochemical detection from basic theory research.

生命和自然的探索已经深入到单细胞、单分子水平。准确、灵敏的单分子检测，特别是DNA和蛋白质等生物分子的单分子检测，将为生物医学带来新的突破。目前基于荧光的单分子检测方法和技术已经相对成熟且得到广泛应用。而单分子电化学检测方法发展相对较晚，目前主要集中于基础理论和方法学研究。受限于检测重现性和可靠性，单分子电化学定量分析及其在复杂体系中的应用仍是一个挑战。本项目拟发展基于生物酶或纳米模拟酶的高效电化学信号放大方法，实现单分子水平电化学检测；结合数字化分析策略，将信号输出为“0”或“1”，无需考虑电化学信号的具体强度，解决单分子电化学检测的信号波动和可靠性问题；利用微加工技术构建微电极阵列或液滴微流控技术，克服电化学高通量检测技术难题；建立数字化电化学单分子定量检测新方法，并将所建立的方法用于复杂体系中病原体的高灵敏检测。本项目将有利于推动单分子电化学检测从基础理论研究迈向应用研究。

电化学特别是单分子/单颗粒电化学检测的重现性及可靠性问题限制了其在实际分析检测的广泛应用。可靠、准确的单分子电化学定量分析方法及其在复杂体系中的应用仍是一个挑战。本项目研究内容主要涉及：1）发展了基于酶促金属化的电化学信号放大技术和纳米信号放大技术，并结合微流控技术建立了数字化单分子/单病毒酶联免疫检测新方法，2）发展了基于单颗粒碰撞的电化学高灵敏检测新方法；3）建立了复杂样品中禽流感、埃博拉等病毒的高灵敏检测新方法。4）发展了基于微流控芯片的肿瘤液体活检及诊疗新技术。本项目发展了高效电化学信号放大技术，实现了单分子/单颗粒水平的高灵敏检测，并结合数字化分析策略和微流控技术，建立数字化单分子电化学定量检测新方法，该类方法不采用电化学信号的强度进行定量分析，可克服单分子电化学检测中的重现性和可靠性问题，为复杂样品中病原体的高灵敏定量检测提供一种新思路。本项目建立了基于碱性磷酸酶酶促金属化、及杂交链式反应-酶促金属化-溶出伏安多重级联信号放大策略、荧光-磁性多功能纳米球等多种信号放大策略，实现了单分子水平的高灵敏检测。结合微电极阵列技术建立了数字化单分子酶联免疫电化学定量检测新方法，克服电化学单分子定量检测重现性差，难用于定量分析的难题；基于纳米富集放大信号的能力，建立了基于多功能纳米球的多重数字化单病毒免疫检测新方法，用于三种禽流感病毒同步检测。建立了基于液滴微流控技术的数字化单颗粒定量新方法和基于单颗粒碰撞的电化学高灵敏检测新方法。并将建立的方法和技术用于复杂样品中禽流感病毒和埃博拉病毒的高灵敏检测。项目研究成果为单分子电化学检测信号波动和可靠性问题的解决提供了新思路，推动了单分子/单颗粒电化学技术在分析测量领域的应用。项目执行期间共发表论文SCI论文26篇，分别发表在Analytical Chemistry（9篇），Biomaterials（1篇），Lab on a Chip（2篇），Biosensors and Bioelectronics（1篇），ACS Applied Materials & Interfaces（2篇）等刊物上。申请国家发明专利2项；培养博士7名，硕士4名。

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