噬菌体基因组难测序之谜与细菌免疫机制研究

全基因组测序是理解物种遗传信息、基因功能、生物学特性及生存机制的重要途径。目前测序百万碱基级别的基因组已经比较容易了。然而，我们却遭遇了一株基因组难以测序的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1，“鸟枪法”测序难以解析此噬菌体的基因组序列。本研究通过三代不同的测序技术，终于成功完成了全长91,715 bp的PaP1基因组解析。基于PaP1基因组的比较分析，我们将铜绿假单胞菌噬菌体PaP1、JG004、PAK_P1及vB_PaeM_C2-10_Ab1确定为一个铜绿假单胞菌肌尾噬菌体新属，命名为PaP1样噬菌体属。单分子实时（SMRT）测序结果显示PaP1基因组含大量修饰碱基(7557 个，占全部碱基的8.24%), 其中51个为6-甲基腺嘌呤（m6A），152个为4-甲基胞嘧啶（m4C），其余为修饰类型尚不清楚的修饰碱基。我们的研究结果表明：大肠杆菌DH5α 含有能识别修饰碱基的Endo V酶，在“鸟枪法”建库过程中，该酶识别并降解了含有修饰碱基的插入片段，导致PaP1基因组“鸟枪法”测序的失败。解决此问题的策略有二：一是使用不依赖于构建“鸟枪法文库”的测序技术（如454测序），二是使用大肠杆菌DH5α的nfi-突变株作为“鸟枪法”克隆建库的宿主菌。本研究首次报道了细菌通过Endo V酶学活性实现排除外来DNA侵染、保持自身遗传稳定性的新的免疫机制。由于Endo V同时具有核酸内切酶和外切酶活性，它对插入片段的破坏性特别大，故Endo V在细菌免疫中具有极为重要的作用。.　　在本课题形成论著4篇，其中2篇SCI论著和1篇中文论著已正式发表，1篇SCI论著已完成撰写，正在投稿中，获授权国家发明专利1项，培养博士研究生1名，硕士研究生1名。