铜绿假单胞菌耐受噬菌体PaP1突变频率及耐受机制研究

本课题以裂解性噬菌体PaP1及其宿主铜绿假单胞菌PA1为模型，分别研究了细菌PA1耐受噬菌体的突变频率、耐受机制以及噬菌体PaP1感染细菌的机制，获得以下结论：. 1. 测出宿主菌PA1耐受噬菌体PaP1的突变频率约为3.02X10-5.. 2. 发现了宿主菌一种新的噬菌体耐受机制：首先，以噬菌体PaP1感染宿主铜绿假单胞菌Pa1, 筛选出噬菌体耐受菌株。该菌株除具有噬菌体耐受性外，其菌落颜色由白色变异为棕色。该变异株命名为PA1r 菌株。 随后，我们对噬菌体敏感的亲本株PA1和耐受株PA1r 进行了全基因组测序和比较基因组学分析。发现PA1r 基因组中丢失了一段219.6KB的片段，其中包含了192个基因。进一步研究发现，192个基因中的galU基因丢失，会导致宿主的噬菌体耐受。深入研究发现，galU基因为细菌合成LPS中的关键基因，galU基因丢失导致宿主菌表面失去LPS，宿主菌变得不能再与噬菌体相吸附，进而导致噬菌体耐受，这表明细菌PA1与噬菌体PaP1结合的受体是LPS。在galU基因的上游，同时丢失的还有 hmgA基因。该基因的丢失，导致一种棕色底物尿黑酸的积累，致使突变菌表现为棕色菌落。LPS是噬菌体PaP1的受体，LPS的丢失导致噬菌体结合受体的丢失，因此噬菌体无法吸附上PA1r。我们将细菌通过丢失一个大片段，因而丢失噬菌体结合受体，从而变得耐受噬菌体的新机制称为“断臂求生”。 . 3. 鉴定了噬菌体PaP1与宿主结合的“受体结合蛋白”（receptor binding protein, RBP)是尾丝蛋白(tail fiber) 。我们发现铜绿假单胞菌噬菌体PaP1和JG004的基因组序列非常相似，但是两个噬菌体的宿主却不同：PaP1感染PA1，而JG004感染PAO1。通过对尾丝蛋白的系统突变技术，发现噬菌体JG004的尾丝蛋白的一个点突变后使得其可以同时感染PA1和PAO1。 而将PaP1的尾丝蛋白替换为JG004的尾丝蛋白后，“重组的噬菌体PaP1” 完全改变了其宿主特异性，可以感染细菌PAO1了。由此，我们确定了铜绿假单胞菌噬菌体的尾丝蛋白是吸附宿主的RBP。通过对该蛋白的遗传改造，可改变噬菌体的宿主谱，这为噬菌体治疗研究奠定了基础。