莪术醇单链抗体（scFv)诱导广西莪术提高莪术醇含量的研究

本项目以广西道地药材广西莪术（Curcuma kwangsinensis S.G..Lee et C.F.Liang）为研究对象，针对其挥发油中的抗肿瘤活性化合物莪术醇（Curcumol），进行了单克隆抗体（mAb）制备及单链抗体（scFv）基因构建的研究。在细菌中表达、纯化并复性了scFv蛋白。进一步利用慢病毒表达系统在小鼠骨髓瘤细胞SP2中表达了scFv基因。尝试了鉴定莪术醇相互作用蛋白的研究工作，以期揭示莪术醇抗肿瘤的作用靶点及机理。主要结果如下。.1、以DMAP做催化剂，莪术醇与丁二酸酐为反应物得到的莪术醇丁二酸单酯半抗原，再行EDC法与载体蛋白偶联合成的莪术醇完全抗原，具有很好的免疫原性，可作为免疫原应用于抗莪术醇mAb的制备。该合成方法反应条件温和、质量稳定，产率为87%。.2、应用杂交瘤技术制备出了能够高度分泌抗莪术醇mAb的细胞株，经腹水制备、ProteinG琼脂糖凝胶亲和色谱柱纯化，可得到含量在90%以上的抗莪术醇的mAb。对抗体进行特征鉴定与评价，显示抗体的效价高，亲和性好，特异性强。.3、初步建立了莪术醇ELISA分析方法，并进行了方法学考察，显示该方法的线性、重现性（9.02%）、精密度（＜9%）、加样回收率（10.01%）、板间（＜10%）板内（＜10%）差异程度符合免疫分析要求，最低检测限为78ng.ml-1。以该法测定广西莪术、温莪术、含莪术醇的生物样本，其检测结果与气相色谱分析结果无显著差异。.4、克隆到了抗莪术醇mAb轻链和重链基因。通过重叠延伸拼接的方法构建了抗莪术醇单链抗体（scFv）基因，并将scFv基因克隆在细菌表达载体pET21a中。scFv基因可以在细菌中高效表达，但形成了包涵体。进一步利用Ni-NTA树脂纯化scFv蛋白，在复性缓冲液中透析复性scFv，得到可溶性蛋白。.5、在小鼠骨髓瘤细胞SP2中成功地表达了C端带有Flag标签的抗莪术醇scFv蛋白。此外尝试了鉴定莪术醇相互作用蛋白研究，建立了初步的实验路线与方法。.研究结果为广西莪术资源开发及品质研究奠定了一定的基础，同时也建立了抗体基因工程的基本平台和技术。