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显微切割联合单细胞PCR技术鉴定干细胞移植DMD模型鼠外源性再生肌细胞、血管和神经及其再生机制的研究
结题报告
批准号:
81471280
项目类别:
面上项目
资助金额:
80.0 万元
负责人:
张成
依托单位:
学科分类:
H0911.神经-肌肉接头和肌肉疾病、自主神经疾病
结题年份:
2018
批准年份:
2014
项目状态:
已结题
项目参与者:
朱瑜龄、孙毅明、郑民缨、操基清、张惠丽、利婧、李亚勤、张誉、梁颖茵
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中文摘要
DMD是一种进行性肌萎缩、腓肠肌假性肥大的X连锁隐性遗传病。患者12岁不能行走,20多岁死亡。目前认为基因治疗与干细胞治疗相联合是最佳治疗方法。我们前期的研究表明:移植治疗后肌肉中抗肌萎缩蛋白表达增多,mdx鼠的运动功能和肌肉病理改善、生命期限延长。但这些抗肌萎缩蛋白阳性肌细胞是供体来源的新生肌细胞还是回复肌纤维?如何对单个新生的神经肌肉接头进行鉴定?为了回答这些再生医学的基本问题,本研究拟(1)采用激光捕获显微切割技术,对脂肪干细胞移植的mdx鼠的同一肌肉切片,随机切下单个抗肌萎缩蛋白染色阳性的肌细胞、所支配的神经纤维和血管内皮细胞,再用单细胞PCR检测这些肌细胞、血管和神经是否含有供体的DNA成分,以确定是否来自供体干细胞的分化;(2)对这些鉴定后的单细胞再用RT-PCR法,分析其成肌、成血管和成神经因子的动态变化,从单细胞的角度探讨其再生的机制,这对于丰富再生医学理论有重要意义。
英文摘要
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common genetic muscle disease with characteristic of progressive degeneration and necrosis in skeletal muscle. Afflicted individuals often loss of the ability to walk independently by 12 years and die in their thirties,usually from respiratory and cardiac failure. Based on our previous research, we found that muscle regenerated with increased functional dystrophin, ameliorated motor function, improved pathology and extended life-span in mdx mice after stem cell transplantation. While, it is still not sure that whether those regenerated dystrophin positive myocyte were from donors. And how to identify the new regenerated neuromusclar junction? In order to solve those basic questions of regenerative medicine, in this study, we use Laser Capture Microdissection to separate the single cell of dystrophin positive myocyte ,as well as its connected vascular endothelial cell and innervated neuron. We will apply single cell PCR to sequencing their DNA compared with donor DNA. We will also use RT-PCR to detect their growth factors genes expression of those single cells, which will help us a better understand of those regenerative mechanism and also enrich regenerative medicine study.
Duchenne型肌营养不良症(Duchenne MuscularDystrophy, DMD)是一种以进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征,同时累及心肌和呼吸肌,部分患者伴有智力障碍的X连锁隐性遗传病。DMD尚无特效的治疗方法,目前的研究显示基因治疗和干细胞的治疗有可能是治疗该病最有前景的两种治疗手段。在我们前期的研究结果显示经干细胞移植治疗后的DMD模型鼠,可观察到其肌细胞膜上dystrophin表达增多,运动功能和肌肉病理改善,生命期限的延长,但尚缺乏干细胞移植治疗后肌细胞再生的直接证据。本项目通过C57小鼠来源的脂肪干细胞尾静脉移植治疗mdx鼠的治疗研究模型,观察到了干细胞治疗后mdx鼠骨骼肌中肌肉、血管和神经肌肉接头的再生,并应用激光显微切割的技术分离干细胞治疗后小鼠鼠骨骼肌切片中单个肌细胞,通过单细胞测序鉴定出了部分分离的单细胞细胞为外源性干细胞移植来源的直接证据。并探讨了一种新的对细胞毒性较低的脂肪干细胞成肌诱导的方法,在体外通过在GSK3β抑制剂BIO,forskolin,bFGF和脂肪干细胞培养基上清的诱导培养下,将脂肪干细胞诱导为肌肉祖细胞,且诱导的肌肉祖细胞能够在体外分化为成熟的多核肌管,肌管融合指数约为 28%,克服了以往脂肪干细胞成肌诱导效率低和诱导剂对细胞毒性的问题。当脂肪干细胞来源的肌肉祖细胞移植入 mdx 鼠体内时,能在体内长期存活、迁移并促进肌肉再生。本研究不仅证实了干细胞治疗 DMD 疾病的有效性,并且通过探讨脂肪干细胞新的成肌诱导的方法,可以让我们加深了解干细胞在体内的分化机制, 进一步丰富了再生医学知识, 具有十分重要的科研意义和临床指导价值。
期刊论文列表
专著列表
科研奖励列表
会议论文列表
专利列表
DOI:--
发表时间:2018
期刊:中国现代神经疾病杂志
影响因子:--
作者:张成;王倞
通讯作者:王倞
DOI:--
发表时间:2017
期刊:中国现代神经疾病杂志
影响因子:--
作者:张成
通讯作者:张成
DOI:--
发表时间:2018
期刊:中国现代神经疾病杂志
影响因子:--
作者:王倞;李亚勤;张惠丽;朱瑜龄;何若洁;李欢;林金福;张成
通讯作者:张成
DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2017.0087
发表时间:2017
期刊:中山大学学报(医学科学版)
影响因子:--
作者:孙毅明;朱瑜龄;利婧;李欢;何若洁;王倞;陈孟龙;张成
通讯作者:张成
DOI:--
发表时间:2018
期刊:中国现代神经疾病杂志
影响因子:--
作者:张成;王倞
通讯作者:王倞
人源化肌肉嵌合Duchenne型肌营养不良症模型鼠的建立及CRISPR/Cas9编辑模型鼠缺陷基因并恢复dystrophin长期表达的研究
  • 批准号:
    81771359
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    54.0万元
  • 批准年份:
    2017
  • 负责人:
    张成
  • 依托单位:
缺陷基因修复的脂源性干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症模型鼠后形成神经肌肉再生单位的研究
  • 批准号:
    81271401
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    65.0万元
  • 批准年份:
    2012
  • 负责人:
    张成
  • 依托单位:
重组杆状病毒基因修饰后的DMD患者CD133+干细胞动脉移植治疗dko鼠及成肌机理的研究
  • 批准号:
    30870851
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    30.0万元
  • 批准年份:
    2008
  • 负责人:
    张成
  • 依托单位:
定向诱导人髓源性肌祖细胞移植治疗DMD的实验研究
  • 批准号:
    30370510
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    18.0万元
  • 批准年份:
    2003
  • 负责人:
    张成
  • 依托单位:
骨髓干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症的实验研究
  • 批准号:
    30170337
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    16.0万元
  • 批准年份:
    2001
  • 负责人:
    张成
  • 依托单位:
缺失型DMD 基因内含子特征及外显子缺失机制的研究
  • 批准号:
    39870804
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    12.0万元
  • 批准年份:
    1998
  • 负责人:
    张成
  • 依托单位:
国内基金
海外基金