大鼠新基因LM23选择性剪接异构体在精子发生中的功能和作用机制研究

LM23(GenBank: AF492385)是本研究小组发现的大鼠睾丸组织特异表达基因。本研究组前期研究发现，LM23通过促进细胞周期进程调控精子发生,并从大鼠睾丸组织中克隆出一个新的LM23基因选择性剪接异构体svLM23,其在大鼠的多种组织广泛表达，且能明显促进生精细胞增殖。.为了进一步研究LM23 （Spdya）在精子发生中的功能及其分子调控机制，本课题利用 Gateway技术构建Spdya表达载体，通过DNA显微注射的方式获得LM23 （Spdya）过表达转基因的小鼠系；通过表型和生育分析发现过表达转基因小鼠产仔率显著高，雄雌鼠仔的性别比高（2:1)，推测该基因可能影响性别分化。本课题已经建立条件型LM23（Spdya）基因敲除小鼠模型，发现杂合子鼠（LM23+/-）能生育，纯合子鼠（LM23-/-）尚在幼崽阶段，有待在整体、细胞和分子水平上，进一步研究LM23（Spdya）对于小鼠发育和精子生成的作用和机制。.本课题还对调控LM23（Spdya）基因表达的miRNA进行了筛选和鉴定，发现miRNA-23b调节LM23的表达影响生精细胞的增殖和凋亡。另外,本研究发现过表达svLM23对293T细胞细胞有促进增殖，抑制凋亡的作用。双荧光素酶报告基因系统检测发现svLM23对NF-κB通路有激活作用，对wnt通路有轻微的抑制作用。本课题还利用RT-PCR 和 real-time PCR方法，检测了LM23和svLM23在大鼠出生后不同时期的表达量,结果显示LM23随着出生天数的增加表达量逐渐增高，在出生后30天的大鼠睾丸中表达量达到最高，之后表达量又下降。而svLM23的表达量则无明显的变化。.最后，本研究采用高通量小RNA 测序系统研究了miRNA 在小鼠B 型精原细胞(BSc)和初级精母细胞(PSc)中的表达谱. 结果显示,在这2种细胞类型中let-7 miRNA 家族的表达水平都相当高。并且在BSc 向PSc 的转化过程中, miR-21, miR-140-3p,miR-103, miR-30a, miR-101b 和miR-99b 的表达水平明显降低。结果提示，这些miRNA 参与调控与细胞凋亡、细胞增殖和分化、连接组装和细胞周期调控相关的诸多基因的表达.