Nurr1基因启动区CpG位点的甲基化机制与多巴胺代谢失调的关系研究

Nurr1缺陷将增强DA神经元对毒素的敏感性。本课题我们开展了散发性PD患者Nurr1基因DNA甲基化分析，检测Nurr1基因表达水平，以及Nurr1基因缺陷增加DA神经元对环境毒素敏感性的机制。工作方案：1）收集PD患者血标本，提取DNA，分析Nurr1启动区CpG甲基化，2）构建细胞/动物模型，分析细胞应激对Nurr1，Wnt，HtrA2等信号分子的影响。研究结果：1）已完成300例PD病人Nurr1启动子区BSP分析，发现仅少数PD病人中存在Nurr1甲基化，其频率不高，由于PD尸解脑标本少，我们增加了PD动物模型，进一步探讨黑质区Nurr1甲基化水平。检测发现，PD鼠黑质区Nurr1甲基化水平不高，PD鼠行走迟缓，步态不稳，尾部僵硬，甚至出现头颈部震颤，小鼠黑质区TH阳性神经元数明显减少。2）我们检测了440名PD病人白细胞中Nurr1表达水平。发现早发型PD患者白细胞Nurr1基因表达较晚发型PD有降低趋势；DA激动剂组PD患者Nurr1 mRNA水平显著升高，而其它治疗组Nurr1 mRNA水平改变不明显，提示激动剂可诱导外周血淋巴细胞中Nurr1基因表达。3）我们建立了pCMX- hNurr1GFP稳定表达的细胞株，利用SH-SY5Y等细胞瞬转hDnmt3a/b、mDnmt3a/b。发现Nurr1激动剂SH1可以浓度依赖性促进Nurr1 mRNA表达，但未发现Nurr1基因甲基化水平出现改变。4）利用Nurr1 siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，经100uM6-OHDA处理，发现内质网应激相关蛋白Bip和Chop的蛋白水平随处理时间延长而升高，而HtrA2蛋白水平随时间延长而降低。siRNA干扰HtrA2/Omi后，SH-SY5Y细胞对6-OHDA敏感性升高，细胞凋亡增多。利用荧光双标技术，证实wnt通路受体Frizzled-1与TH在DA能SH-SY5Y细胞中共表达，应用Nurr1 siRNA 干扰，经6-OHDA处理后，发现Wnt通路中信号分子发生改变，包括GSK3β的磷酸化水平改变，p-GSK3β(Ser9)随处理时间延长而降低，而p-GSK3β(tyr216)随时间延长而升高。