丁香假单胞菌冰核蛋白跨膜分泌效应分子的研究

丁香假单胞菌所产生的冰核蛋白（Ice Nucleation Protein）是引发宿主植物冻害的效应蛋白，但对其跨膜分泌活性与机制缺乏研究。本项目在克隆一株高冰核活性菌株冰核基因inaQ和构建多种细胞表面展示系统的前期工作基础上，对影响该蛋白跨膜分泌的效应分子与作用机制进行了研究。首先利用全长和不同长度截断片段的InaQ作为锚定基序和用绿色荧光蛋白作为报告蛋白构建了多种细胞表面展示系统，对影响丁香假单胞菌MB03菌株所产生的InaQ蛋白的跨膜分泌转运的结构域、影响因子与多重运载蛋白组合的跨膜分泌效应进行了测定，确定了直接决定该蛋白跨膜分泌的蛋白质结构域属性。然后，通过建立体外免疫学检测系统、转座突变系统和测定MB03菌株的全基因组序列等，对影响InaQ跨膜分泌转运的增强与致若效应分子进行了筛查。对MB03菌株改造建立了一种方便检测和转座效率高的mini-Tn5转座突变系统并获得含1265株突变株的转座突变文库，利用ELASA和原位杂交法从中初筛到InaQ分泌活性改变的突变株40株，并进一步用流式细胞仪测定复筛到活性明显改变的增强突变株5株和减弱突变株4株。利用Tail-PCR技术并结合与基因组序列的比对，确定了柠檬酸合成酶基因等4个突变株的宿主菌染色体转座插入位点。构建了inaQ基因启动子区域5个不同删除组合片段并测定了其对转录活性的影响，发现小分子活性物柠檬酸盐和3,5-二硝基水杨酸等具有增强InaQ表达与分泌的活性。结合全基因组序列预测分析，发现inaQ基因上游调控基因gntR对inaQ具有负调控作用。通过EMSA、DNA酶足迹法、免疫共沉淀（ChiP）试验和全基因组ChIP测序等研究，确定并证实了gntR与inaQ启动子区域的结合，对结合部位进行了精确定位分析，并对Cu离子、小分子效应物对GntR-inaQ启动子的结合活性的影响进行了测定。利用体外ITC试验测定了柠檬酸盐对GntR蛋白的结合作用。由此提出了小分子活性物柠檬酸盐是通过与GntR的结合而减弱了后者对inaQ启动子的结合活性，导致InaQ表达与分泌量的增加的分子机制。在InaQ蛋白分泌活性应用方面，分别构建了表面展示高丝氨酸内酯酶、多铜氧化酶、金属硫蛋白、有机磷水解酶的展示系统，并分别用于植物软腐病防治、合成染料脱色、重金属吸附和有机磷化物降解的活性系统构建与测定。