产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶的晶体结构解析及其催化识别研究

课题组前期挖掘的产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS）能特异性识别甘草酸外侧的糖苷键水解生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），而大肠杆菌表达的重组酶(PGUS-E)还具备了以GAMG为底物水解内侧的糖苷键生成甘草次酸的功能。为阐明PGUS-E的催化构效机制，本项目以PGUS-E及其突变体为研究对象，解析PGUS-E及其复合物的晶体结构，研究PGUS-E的催化与结构识别机制，在此基础上对该酶的底物特异性进行理性改造；并探索产紫青霉诱导产酶优化及PGUS的分离纯化工艺。主要研究结果如下：.利用X-射线衍射技术解析了分辨率为2.5 Å 的PGUS-E晶体结构，酶蛋白为同源四聚体，由二个非不对称单元呈35°交叉排列构成，每个非不对称单元由二个亚基组成，每个亚基由N端的糖基结合域，C端的TIM桶状结构域及中间的免疫球蛋白状β-三明治结构域构成，其催化活性位点为Glu 414和Glu 505，水解糖苷键的机制为保持型。构建了PGUS-E E414D/E505D突变体，将其分别与底物GAMG、产物β-D-葡萄糖醛酸共晶，解析了酶与底物、酶与产物复合物的晶体结构。发现酶和糖基的结合主要依靠氢键和静电相互作用，包括Ser 332和Asp 162分别与糖基3位和4位碳上的羟基、Asp 567和Lys 569与糖基6位碳上的羧基形成的四个氢键，Asp 162和Lys 569以及Arg 563与糖基的羧基形成的三对静电相互作用。酶在结合β-葡萄糖醛酸后Tyr 469残基上的苯环旋转了约112˚，使得底物进入活性中心且自身形成了底物通道的一部分；酶与底物复合物晶体结构中尽管苷元已脱落，但分析显示Loop 560-562在结合底物后向活性中心移动约2.6 Å，Loop 471-474沿着活性中心移动了约7.1 Å，二者的移动形成了一个新凹槽，GAMG和复合物结构对接发现，GAMG在新形成的凹槽处和酶结合，Tyr 469、Trp 472及Ser 562参与了对底物苷元部位的识别。另外，Asp 509对于该酶的底物特异性十分重要。通过截除、突变及替换等方法证明细菌环（Loop 363-377）对PGUS-E的催化活性及底物特异性有重要作用，突变体A367V对GAMG催化效率下降了29.49%而对甘草酸的催化效率则则提高了50.15%。