AchR-Fc融合蛋白靶向BCR治疗重症肌无力的基础研究

本研究以AChRα亚单位基因片段为模板，通过PCR的方法扩增AChRα亚单位胞外段全长基因片段（Hα1-210），将其插入含有CMV启动子、小鼠Kappa链先导序列以及人IgG1从铰链区到CH3基因片段的真核表达载体pAN1782中，构建重组表达载体pAN-Hα1-210；瞬时转染CHO-K1细胞后取上清，ELISA和Western blot鉴定AChR-Fc融合蛋白的表达；G418筛选转染后细胞，建立稳定表达细胞系；Protein A亲和层析柱纯化表达的融合蛋白，SDS-PAGE进一步分析AChR-Fc融合蛋白的表达和纯度。利用FCM检测抗AchRAb杂交瘤细胞TIB175表面BCR和FcγRⅡB表达，并鉴定AchR-Fc融合蛋白对杂交瘤细胞的亲和力；体外细胞系实验证实AchR-Fc融合蛋白可抑制杂交瘤细胞增殖，促进其凋亡，还可通过其Fc段介导效应细胞和补体特异性诱导杂交瘤细胞的凋亡。构建EAMG大鼠模型，无菌分离大鼠脾细胞，初步分析了AchR-Fc融合蛋白在活体外对EAMG大鼠脾AchR反应性B细胞的作用；通过尾静脉给药的方式，将AchR-Fc融合蛋白作用于EAMG大鼠，在体实验发现融合蛋白治疗组血清中抗体滴度明显下降，进一步用ELISPOT分析发现融合蛋白治疗组脾脏中AChR反应性B细胞数清除率明显增高。本研究首次提出靶向清除自身反应性B细胞的新策略，有望建立特异性治疗自身免疫病的新平台。