β-Sarcoglycan在mSOD1介导ALS骨骼肌病变中的机制研究

Amyotrophic Lateral Sclerosis(ALS) is a fatal neurodegenerative disease with rapid progress .With no effective treatment for ALS, the patients' life expectancy is only 2-5 years. Although the exact molecular mechanisms are unclear, mutations in the SOD1 gene is thought to be the key molecular factors associated with ALS. We found a new SOD1 gene mutation type (mSOD1) in the ALS family. Preliminary experiments confirmed that the expression of mSOD1 can reduce the activities of neurons, suggesting that mSOD1 may contribute to the pathogenesis of the family. The interaction protein is β-Sarcoglycan（β-SG） which is the transmembrane glycoproteins providing protection of the sarcolemma and closely related to the muscle membrane stability. We can infer that mSOD1 have direct effects on skeletal muscle. It has proven that that skeletal muscle is a primary target of the mutation of SOD1, but the mechanism is unclear. We hypothesized that the interactions between mSOD1 and β-SG leads directly to skeletal muscle damage in ALS patients, by producing the membrane instability that produces increased intracellular calcium as well as disrupted nitric oxide signaling. In this project, our team plans to research its influence on skeletal muscle cells and its mechanism in cells and vivo level through regulating β-SG expression, to determine whether β-SG is a common effector molecule in the different causes of ALS skeletal lesions, thus providing a new treatment target for ALS.

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进展迅速的神经系统疾病，患者平均寿命为2-5年，缺乏有效的临床治疗手段。SOD1突变被认为是其发病的关键分子事件，但具体机制尚不清楚。我们前期研究发现了一种新的SOD1基因突变类型（mSOD1），在证实其可降低神经元活性，同ALS发病密切相关的基础上，发现骨骼肌细胞跨膜蛋白β-Sarcoglycan（β-SG）可与mSOD1发生相互作用。提示mSOD1可直接作用于骨骼肌细胞。国外研究报道也证实骨骼肌是SOD1突变的靶器官，但具体作用机制未见报道。我们推测，mSOD1与β-SG发生相互作用，引起细胞膜稳定性下降和钙离子内流、下调nNOS活性，从而导致了肌肉的损害和萎缩。本项目拟在细胞和在体动物水平上调控β-SG的表达，探讨其对骨骼肌细胞的影响及机制，进一步论证β-SG是否作为一种共性效应分子，在不同原因ALS骨骼肌病变中发挥作用，为ALS的治疗提供新的靶点。

国内外首次报道了一种新的SOD1(mSOD1)基因突变型，构建携带mSOD1基因的PCI质粒载体，通过受精卵原核注射的方法，自主构建了表达这种新的突变SOD1的转基因小鼠模型，利用PCR方法鉴定出生的后代，结果证实获得了mSOD1转基因小鼠，采用电子显微镜观察转基因小鼠的脊髓及皮层运动神经元的超微结构，其运动神经元胞质中可见不溶性致密嗜锇酸颗粒沉积。采用转轮实验和足迹分析观察转基因小鼠的临床表型，转基因小鼠在转轮上停留时间明显短于野生型小鼠（P<0.01）。转基因小鼠在出生8月左右出现双下肢跛行、拖曳，足迹分析显示转基因小鼠的后肢足间距明显小于野生型小鼠（P<0.01），足迹欠规整。我们成功地构建了mSOD1转基因小鼠，转基因小鼠出现了类似ALS的临床表型及病理改变，说明该突变SOD1类型是ALS发病的一种新的致病基因。.免疫共沉淀技术证实，与野生型SOD1蛋白相比，mSOD1蛋白能较强地结合β-Sarcoglycan（β-SG），mSOD1能和β-SG共沉淀，在激光共聚焦显微镜下观察到mSOD1与β-Sarcoglycan存在共定位现象，而野生型小鼠中无共定位现象，提示它们之间具有相互作用，从而表明mSOD1可能通过影响β-SG蛋白的功能，参与了ALS的发病。为此构建了β-SG重组慢病毒过表达载体，以野生型和mSOD1转基因小鼠的骨骼肌细胞为研究对象，观察重组慢病毒在骨骼肌细胞的表达情况。.收集了7个运动神经元病家系及109例散发ALS病例，完善ALS患者的功能MR分析，我们发现ALS患者的双侧中央前回、双侧中央后回及双侧旁中央小叶的脑功能网络、功能连接等脑功能活动的异常改变，ALS组双侧丘脑、左侧海马和右侧杏仁核的体积明显减低。同时建立了基因样本库，采用高分辨率熔解（High Resolution Melt，HRM）进行突变基因筛查。HRM是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG位点的一种新技术，主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。我们采用HRM技术并经基因测序证实，发现了一些新的突变类型。

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