球孢白僵菌耐热力与多菌灵抗性负关联的生理和分子机制

本项目围绕杀虫真菌球孢白僵菌抗逆生物学，以探究生防真菌耐热力和多菌灵抗性机制为目标。首先，利用定点突变技术将β-tubulin 突变热点位点突变成不同类型氨基酸，利用芽生孢子转化体系构建点突变基因重组球孢白僵菌并进行耐热和抗药性评价，阐明球孢白僵菌tubulin 基因的关键位点。结果表明，Q134位点突变的4类转化子均对热胁迫敏感，而且抗药性的增强有限；而E198位点突变的转化子大多大幅增强抗药性，且耐热力下降有限，两者之间的关联也不明显。其次，通过免疫荧光技术分析突变热点改变后微管蛋白亚基的结合特性，明确抗药性改变后菌体在细胞水平的响应机制。突变子突变造成了-微管蛋白对-微管蛋白竞争结合能力增强，但是同时导致了微管的结构异常，同时这种微管不均匀分布在32℃这种对微管具有解离作用的温度下，导致了致死的游离-微管蛋白单体出现，而多菌灵的加入则可以中和这部分游离作用-微管蛋白使得生长得到恢复，而温度越高这种解离作用越强，因此导致高温下多菌灵的有丝分裂恢复作用不明显。另外野生株在高温和多菌灵共同解聚作用下，微管蛋白量非常低，而突变子则仍然很高，这可能与野生株为避免游离-微管蛋白单体毒害对蛋白翻译存在自我调适作用，而突变子则无此功能。第三，通过基因敲除技术，验证热激蛋白的生物学功能，尤其在真菌耐药性方面的功能。结果显示，热激蛋白BbHsp100 (Hsp98)、BbHsp90、BbHsp70、BbHsp60、sHsp (BbHsp30a, BbHsp30b)不仅参与菌株耐热力，还显著参与真菌抗药性响应。第四，利用高通量测序技术，利用多菌灵抗性菌株筛选出多菌灵胁迫相应的基因。结果发现144个基因在多菌灵诱导条件下都稳定上调。其中，约100个基因被分类到代谢途径、遗传信息加工途径、环境信息加工途径和细胞过程途径四大类。第五，建立了基于RNA干扰的生防真菌基因功能鉴定系统，并采用该技术验证CP15基因的生物学功能。结果表明，基因CP15缺失无碍于孢子的产生和萌发以及对紫外胁迫、渗透压和杀菌剂胁迫，却导致孢子耐热力和氧化耐受力的部分丧失。本项目的实施将首次阐明生防真菌耐热力和抗药性负相关的生理和分子机制，将有助于探索生防真菌优良性状集成的有效途径以提高制剂的持效性和稳定性，因而对推动真菌杀虫剂的技术进步具有重要的理论和实践意义。