乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA)的甲基化及其对HBV复制与表面抗原水平的调控

慢性乙肝患者血清HBV DNA和HBsAg水平是抗病毒疗效的监测指标，但个体间基线水平差异较大，其影响因素尚未明确。我们前期研究发现，HBV基因组含3个CpG岛；慢性乙肝患者肝组织内HBV cccDNA CpG岛甲基化程度不一。我们推测，CpG岛甲基化对HBV cccDNA功能可能有调控作用。本课题拟用滚环扩增方法特异性扩增肝组织内HBV cccDNA，用特异性PCR、克隆、测序等方法检测CpG岛甲基化，分析甲基化与病毒载量及HBsAg水平之间的关系；通过细胞转染实验，检测细胞内甲基化酶的表达水平，以了解HBV感染是否促进HBV自身甲基化；观察不同CpG岛分别甲基化对HBV复制和HBsAg表达的影响。该研究将初步阐明HBV cccDNA甲基化对HBV 复制和HBsAg水平的影响，加深对表观遗传学甲基化修饰对HBV cccDNA功能调控作用的认识，为寻找控制HBV复制的新方法提供理论基础。

慢性乙肝患者血清HBV DNA和HBsAg水平是抗病毒治疗重要的监测指标。HBV cccDNA以微染色体形式存在于肝细胞核内，作为病毒mRNA的转录模版，其转录活性直接影响HBV载量以及表面抗原水平。而随着对HBV复制过程研究的深入，人们逐渐认识到表观遗传学修饰是参与HBV cccDNA功能调控的重要机制。申请人圆满地完成了任务书内的所有内容，取得的主要的成果如下：1）本课题组从NCBI数据库中取得A-J基因型的HBV全长序列，用MethPrimer软件分析发现HBV基因组有3个CpG岛，分别与HBV主要调控元件序列重叠。其中岛1临近HBV S基因起始位点，岛2与增强子I、II以及核心启动子重叠，岛3则包含了HBV P基因的起始位点，并且与启动子sp1相重叠。我们还在国际上首次发现了HBV中的CpG岛，作为甲基化的目标作用位点，在不同基因型的HBV基因组中分布存在差异，并且在B、C、D、H基因型的部分HBV DNA序列中，除了目前公认的三个CpG岛外，在不同的位置上还存在着新的CpG岛。2）本课题组通过亚硫酸氢盐PCR测序以及克隆分析技术分析患者肝组织中HBV cccDNA的CpG岛甲基化分布情况，同时结合患者的临床数据进行相关性分析，发现乙肝患者血清的HBV DNA并无甲基化修饰，而肝组织中HBV cccDNA存在一定程度的甲基化。3）HBV cccDNA CpG岛2的甲基化程度与血清中HBV DNA载量呈负相关，推测岛2的甲基化对cccDNA的转录活性具有直接的抑制作用，进而降低了HBV的复制水平。同时我们通过体外定向甲基化构建了含单个CpG岛甲基化的HBV DNA单体，进行体外细胞转染，检测发现HBV CpG岛2的甲基化修饰能够调控HBV转录，进而影响HBV复制，验证了岛2甲基化对HBV cccDNA的功能调控作用。4）我们在国际上首次发现了HBV cccDNA岛3的甲基化程度与血清中HBsAg水平呈负相关，提示岛3的甲基化影响了HBsAg的表达水平，推测可能与sp1启动子活性受到抑制有关。本课题的研究结果证实了DNA甲基化抑制了HBV cccDNA的转录活性，进而降低了病毒复制以及表面抗原水平，明确了DNA甲基化在乙肝病毒复制中重要的调控作用，为探索HBV感染治疗方法提供了新的理论依据。

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