利用分子网络技术和两种新胁迫方法发现隐蔽海洋微生物天然产物

Based on our prior studies on metal stress strategy and co-culture technique for culturing of multispecies strains that are physically separated, here we initiate two new stress methods to activate the silent secondary metabolite gene clusters and improve the molecular networking method to identify the stress-driven pathways. We will culture marine fungi in the protoplasm of myxomycetes in which myxomycetes act as the stressor to unlock the silent pathways of marine fungi. Electrical stimulation will be imposed on the culture of marine microorganism to perturb the biosynthesis of secondary metabolites. In order to effectively pinpoint the stress activated pathways and their products, we improve the molecular networking by merging the neutral loss similarity and fragmentation similarity to identify the specific synthetic pathways and the compounds produced by the activation of those pathways.

基于前期“金属胁迫”和“膜隔离共培技术”发现隐蔽二次代谢产物的研究基础上，我们提出两种新的胁迫技术扰动海洋微生物沉默基因簇的表达，以及改进一种分子网络化方法获得胁迫诱导合成通路下的隐蔽化合物群：一是以黏菌为工具菌的“内生共培”技术，即海洋真菌培养于黏菌原生质团内部，利用黏菌分泌的免疫性黏菌多糖和抗菌多肽等物质对真菌的胁迫扰动发现隐蔽代谢产物；二是以电场为物理胁迫源引起海洋微生物的生理应激，进而扰动二次代谢产物的合成；为了快速准确地分离和鉴定胁迫产物，我们提出了整合中性丢失和质谱碎片相似度计算的分子网络化方法，该方法旨在快速提取胁迫扰动产生的特定合成通路和由此合成的化合物群。

本项目通过开发并设计新型代谢组学分析工具，新颖共培养方法，用于对真菌代谢组学进行以生物活性和结构信息为导向的数据分析、可视化和功能注释，为加快代谢提取物中天然化合物的靶向分离提供新思路。本项目新设计了一个基于MS1和生物活性数据，命名为活性组分筛选平台（BFFP）的Python工作流，以台湾龟山岛热液口沉积物来源真菌Epicoccum sp. GST-5的次级代谢产物为研究对象，以大肠杆菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶为靶标，建立以热图形式的生物活性区块图，以此为指导，利用现代分离纯化手段，综合运用多种波谱解析技术，结合基于NMR量子化学计算的custom DP4+、JBCA以及ECD量子化学计算手段对化合物进行结构解析和鉴定。最终得到2类对EcGUS具有较好抑制活性的多环羟基类化合物。本项目新设计了一个基于MS1和1H-PSYCHE-NMR数据，构建了基于核磁数据的新颖分离网络化方法，命名为化合物结构导向组分筛选平台的Python工作流，以台湾龟山岛热液口沉积物来源真菌Aspergillus sp. GE2-6的次级代谢产物为研究对象，对其包含的共4209个代谢产物进行1H-NMR信号模拟，通过建立PCA分析、热图分析以及网络分析图，探究代谢产物间的相关性。其中以烯烃信号为靶标，从其发酵培养提取物中分离得到24个citreoviridin类聚酮链烯化合物，包括单体化合物，类citreoviridin二聚化合物。同时对citreoviridin类化合物的生合成途径进行了推测，这些二聚化合物是自然界中首次发现的类citreoviridin二聚体，具有6类崭新的碳骨架。利用该平台以低场活泼氢信号为靶标，分离得到5个phenalenone类化合物。通过经典分离纯化手段得到2个α-甲基吡喃酮类化合物，7个γ-丁烯内酯类化合物，11个细胞松弛素类化合物，4个epithiodiketopiperazine类化合物，1个在自然界中首次发现的包含phenalenone和epithiodiketopiperazine杂化骨架的多环化合物。为更高效、更有针对性地挖掘高活性的新颖化合物，本项目以深海真菌、热液口真菌和内生真菌为研究对象，将其与细菌大肠杆菌和鞘氨醇单胞菌分别共培养，通过分析浸膏液相图、质谱总离子流图和分子网络网络化分析，得到了在正常培养条件下未能检测到的化合物。

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