裂褶菌F17锰过氧化物酶对偶氮染料的降解作用及其作用机制

裂褶菌（Schizophyllum sp.F17）为本研究室从自然界分离、保存的一株产锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）的白腐真菌。本项目围绕研究目标，展开了以下主要研究内容：.（1）实验以一定比例的松木屑、稻草和黄豆粉组成的混合营养作为裂褶菌F17发酵产MnP的基质，在固态发酵第6天时，MnP的最大酶活力为11.18 U/g。优化接种量、装载量、温度和含水率等条件，酶活力提高到12.83 U/g。.（2）设计出通气托盘式固态发酵MnP的反应器，并建立了MnP固态发酵过程中菌体生长、酶的产生以及二氧化碳释放速率的动力学模型，获得模型参数，模型在一定程度上反映了裂褶菌F17固态发酵MnP的产生过程。反应器玻璃制成，体积6.4 L，具有通气和散热良好的特点，达到对MnP扩大培养的目的。.（3）经过固态发酵，裂褶菌F17产生以MnP为主的胞外酶。实验通过粗酶提取、盐析、超滤浓缩，DEAE离子交换层析，Sephadex G-75过滤层析等步骤分离得到电泳纯MnP。MnP的相对分子量为45.2KDa，等电点为3.60，含糖量为18 %。在温度15~45℃范围内，MnP的酶活力均较高，最适温度25℃。在pH 4~8范围内MnP均稳定，最适pH为7。.（4）通过简并引物设计，扩增裂褶菌F17基因组，获得606bp的MnP基因中间序列，再分别利用反向PCR和TAIL-PCR技术扩增其两端未知序列，获得MnP完整的基因片段3241bp，其ORF序列为1632bp。该基因包含11个外显子和10个内含子，编码一个由359个氨基酸组成的假定蛋白，推测其分子量为37.9 KDa，等电点（pI）为4.78。GenBank登录号为KC811382。.（5）利用锰过氧化物酶的粗酶液对典型的偶氮染料进行脱色实验，通过设计MnP、LiP、Lac、MnP+LiP、MnP+Lac和LiP+Lac不同的脱色体系，证实了裂褶菌F17分泌的粗酶液中的MnP对偶氮染料脱色起着主要作用。进一步优化了MnP的脱色反应体系，即温度35℃、pH 4.0、0.1 mM H2O2、1.25 mM MnSO4、50mg/l 染料浓度和24U/l MnP，酶反应20min，橙黄Ⅳ、金橙G和刚果红的脱色率分别达到76%、57%和8%。随着酶反应时间的延长，染料的脱色率进一步提高。