胆汁淤积中Ezrin下调肝细胞顶膜MRP2定位表达的分子机制研究-猫眼课题宝

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课题基金

基金详情

胆汁淤积中Ezrin下调肝细胞顶膜MRP2定位表达的分子机制研究

结题报告

批准号：

81170430

项目类别：

面上项目

资助金额：

60.0 万元

负责人：

陈文生

依托单位：

中国人民解放军第三军医大学

学科分类：

H0312.胆石症和胆道系统炎症

结题年份：

2015

批准年份：

2011

项目状态：

已结题

项目参与者：

柴进、蔡仕英、陈磊、吉清、彭志红、何勇虹、李琼、李灵敏、张艳梅

关键词：

MRP2 PKCs 胆汁淤积 Ezrin

国基评审专家1V1指导中标率高出同行96.8%

中文摘要

MRP2存在于极性化肝细胞膜的小管面（顶膜），是参与胆汁淤积发生的重要基因。胆汁淤积时MRP2蛋白表达急剧下降，其机制尚不清楚。胆汁淤积动物模型中Radixin相关的内吞可能导致了MRP2的减少，在人肝细胞尚无研究报道。我们前期对人胆汁淤积肝组织的研究初步发现：MRP2低表达与PKCs激活-Ezrin磷酸化-F actin重排相关，可能是与动物模型不同的致MRP2内吞的机制。本课题将围绕这一设想，首先研究明确胆汁淤积下被激活的PKCs调控了Ezrin磷酸化及可能的位点；其次，利用knockout小鼠、基因点突变、siRNA等技术证实磷酸化的Ezrin是F-actin重排、MRP2顶膜定位表达的关键衔接点，明确其为MRP2内吞的主要因素；最后，证明泛素连接酶E3s是否参与了内吞后MRP2的降解。从而全面揭示人胆汁淤积下肝细胞顶膜MRP2减少的分子机制，为胆汁淤积的临床治疗提供重要的理论依据。

英文摘要

项目背景：.MRP2是参与胆汁淤积发生的重要基因。胆汁淤积时MRP2蛋白表达急剧下降，机制尚不清楚。胆汁淤积动物模型中，MRP2的减少可能与Radixin相关。我们前期研究发现：人胆汁淤积时，MRP2减少可能与Ezrin的磷酸化相关，这可能是与动物模型不同的导致MRP2内吞的分子机制。.主要研究内容：. 1、明确人胆汁淤积状态下PKCs是否被激活及其是否可调控Ezrin Thr567位点磷酸化；. 2、确定Thr567位点磷酸化的Ezrin能否与MRP2、F-actin形成多蛋白复合体；. 3、明确Thr567位点磷酸化的Ezrin是导致F-actin重排、肝细胞顶膜MRP2发生内吞的关键因素；. 4、确定蛋白酶体降解途径（ERAD）的三种关键泛素连接酶（GP78、TEB4或HRD1）是否参与胆汁淤积状态下肝细胞内吞的MRP2的降解过程。.关键数据：. 1、阻塞性胆汁淤积人肝脏MRP2 mRNA无明显变化，而肝细胞顶膜MRP2表达显著减少、总蛋白MRP2表达也明显减少；. 2、阻塞性胆汁淤积人肝脏组织中，MRP2的表达减少与骨架蛋白Ezrin表达相关，而非与Radixin相关；. 3、Ezrin Thr567磷酸化水平在胆汁淤积肝脏显著增高，其脱磷酸化可影响Ezrin与MRP2蛋白间的相互作用。. 4、在HepG2稳定转染细胞株水平，Ezrin Thr567磷酸化可明显减少肝细胞膜MRP2的表达。. 5、阻塞性胆汁淤积下PKC表达显著增加。通过组织和细胞水平实验证明，PKCα可诱导Ezrin Thr567磷酸化，减少HepG2细胞膜上MRP2的表达。. 6、阻塞性胆汁淤积下泛素连接酶E3 gp78表达和MRP2泛素化明显增加。在HepG2稳定转染细胞株，gp78干扰后可增强总蛋白MRP2的表达。. 以上结果表明，胆汁淤积时MRP2表达下调为转录后调控：PKCα激活后，诱导Ezrin Thr567磷酸化，促使膜MRP2内吞，最后由泛素连接酶E3 gp78介导的蛋白酶体降解途径降解。.科学意义：. 本研究阐明了胆汁淤积时MRP2的转录后分子调控机制,完善了胆汁淤积分子的发生机制，深化了对胆汁淤积的认识，为临床治疗胆汁淤积提供了新的思路。

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