光控“四唑-烯”点击化学法原位制备生物可降解水凝胶和微凝胶用于蛋白质药物的控制释放

In this project, novel in situ forming fluorescent biodegradable hydrogels and microgels are designed and prepared via "Tetrazole-alkene" photo-click reaction between methacrylate-functionalized water-soluble biodegradable polymer (like hyaluronic acid, collagen), and tetrazole-functionalized star poly(ethylene oxide) (PEO). Microgels are prepared by inverse emulsion of aqueous droplets of water-soluble biodegradable polymer in continuous oil phase with an aid of oil-soluble surfactants and crosslinking via "Tetrazole-alkene" reaction. This "Tetrazole-alkene" strategy has elegantly combined advantages of photo-crosslinking and conventional click chemistry: (1) crosslinking reaction like conventional click chemistry is efficient, fast and highly specific under physiological conditions, but without copper catalyst; (2) crosslinking reaction like photo-polymerization allows excellent spatiotemporal control, but without use of photoinitiator; (3) the high specificity of "Tetrazole-alkene" click reaction avoids conjugation and thereby deactivation of bioactive proteins; (4) the fluorescent nature of hydrogels and microgels facilitates monitoring of crosslinking reaction as well as hydrogel integrity in vivo. In this project, a series of in situ macrogels and microgels with different structure and physical properties will be developed using "Tetrazole-alkene" photo-click reaction for sustained release of therapeutic proteins like IFNα2b, IL-2 and IL-12.

本项目探索光控"四唑-烯"点击化学法原位制备生物可降解荧光水凝胶和微凝胶用于蛋白质药物控制释放。该水凝胶由水溶性可降解聚合物（如透明质酸、胶原蛋白等）的甲基丙烯酸酯衍生物和聚环氧乙烷的四唑衍生物在低光强照射下交联制备。微凝胶由反相乳液法将聚合物水溶液乳化后光照交联方便制备。该方法有机结合了光聚合和常规"点击化学"的优点：1）具有常规"点击化学"的快速高效、专一和反应条件温和的优点，但无需铜盐等毒性催化剂；2）具有光聚合的时空可控的优点，但无需光引发剂；3）反应专一性的特点使负载的蛋白质不参与交联，可很好保持生物活性；4）制备的水凝胶发强荧光，可用于观察凝胶载体在体内的变化。本项目将具体研究用光控"四唑-烯" 点击化学法制备具有不同性能结构的生物可降解荧光水凝胶和微凝胶，并将其用于蛋白质抗肿瘤药物IFNα2b、IL-2和IL-12的长期局部控制释放，以期实现高效低毒的肿瘤蛋白质治疗。

蛋白质药物相对于小分子药物具有高活性、高特异性、低毒性等优点，在肿瘤治疗中有巨大潜力。但是，蛋白质药物在体内不稳定、易酶解、常需要长时间大剂量的用药。因此，急需开发合适的载体来保护蛋白质药物的生物活性和实现其可控释放。本项目研究用光控“四唑-烯”点击化学法制备生物可降解荧光水凝胶和纳米凝胶来实现蛋白质药物的控制释放。主要结果如下：1）用四臂聚乙二醇的四唑衍生物和甲基丙烯酸酯衍生物通过光控“四唑-烯”点击化学法快速制备水凝胶。该水凝胶能实现细胞色素C（CC），球蛋白（Ig）和人重组白细胞介素2（rhIL-2）等蛋白质药物的有效包裹和持续定量释放，且释放出来的蛋白质能保持其天然的二级结构和生物活性。2）研发了还原响应自发荧光的光控“四唑-烯”点击透明质酸纳米凝胶（HA-NGs），HA-NGs能高效包载CC，载药量高达40.6 wt%。包载CC的HA-NGs（CC-NGs）具有还原响应性，且释放的CC能很好地保持生物活性。CC-NGs在80或160 nmol CC equiv./kg时能有效地抑制裸鼠皮下MCF-7移植瘤的生长。3)用光控“四唑-烯”点击化学交联法制备了包载果粒酶B（GrB）的透明质酸纳米凝胶（GrB-NGs）。GrB-NGs对MCF-7细胞的半抑制浓度(IC50)为3.0 nM，这比临床常用的DOX纳米药物Doxil低90000多倍。体内抗肿瘤实验显示GrB-NGs在3.8-5.7 nmol GrB equiv./kg的极低剂量时就能完全抑制裸鼠原位A549人肺癌移植瘤的生长。4）用透明质酸接枝的胱胺四唑衍生物和碘克沙醇通过光控“四唑-烯”点击化学交联制得生物响应性荧光纳米凝胶（HAI-NGs）。在荷MCF-7人乳腺癌的裸鼠中，HAI-NGs表现出了比临床广泛使用的碘克沙醇造影剂更强的CT信号。5）用HA的四唑衍生物为乳化剂，结合纳米沉淀法和光控“四唑-烯”点击化学法制得HA涂层的载有多西他赛的PLGA纳米药物（DTX-HPNPs）。DTX-HPNPs能有效地抑制裸鼠皮下MCF-7移植瘤的生长。因此，这种无需催化剂、专一、高效、光控的“四唑-烯”点击化学反应制备的荧光水凝胶和纳米凝胶能用于蛋白质药物的无损伤包裹和可控定量释放，实现了对皮下MCF-7人乳腺癌和原位A549肺癌等肿瘤的安全高效治疗，为载蛋白质凝胶体系的临床前试验奠定了较好的基础。

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