重组Amelogenin和EMPs诱导骨髓基质细胞成骨分化及其调控机制的比较研究

背景：通过组织工程学手段，釉基质蛋白(EMPs)作用于骨髓基质细胞（BMSCs），可望获得理想的牙周组织再生。而釉原蛋白（Amelogenin，Am）是EMPs的主要成分。研究表明重组人Am （rhAm）具有诱导牙周再生的能力。目的：本课题比较研究rhAm和猪EMPs诱导人BMSCs成骨分化的作用及其调控机制。.方法：选择BL21/pET28a-His-SUMO-rhAm表达系统，经诱导表达和酶切纯化得到25KDa全长rhAm；乙酸法提纯猪EMPs。体外培养人BMSCs，采用MTT测定细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期。采用RT-PCR及Western blot方法检测rhAm和猪EMPs作用BMSCs后成骨因子（Runx2、OCN、ALP、COL-I）和及NF-κB信号通路分子相关因子（P65、P52、Fra-1）的变化，观察时效关系；利用阻断剂/激活剂,调控细胞信号分子后，检测rhAm和猪EMPs作用人BMSCs后NF-κB信号通路分子和成骨因子的表达，并观察时效关系。同时采用碱性磷酸酶和茜素红染色检测蛋白对人BMSCs成骨矿化作用的影响。.结果：乙酸法成功提取了猪EMPs，经鉴定符合Amelogenin占优势的猪釉基质蛋白的典型特征；成功体外合成重组人釉原蛋白， Western blot证实为25kDa全长rhAm。MTT法和BrdU掺入法均表明，EMPs和rhAm能显著增加BMSCs的DNA合成，其中200μg/ml的EMPs与10μg/ml的rhAm作用效果之间无显著性差异。RT-PCR、Western blot及细胞染色的结果提示rhAm和EMPs均可明显促进BMSCs中成骨相关因子的基因及蛋白表达，且与作用时间相关。而NF-κB信号通路在蛋白作用早期时受到激活，随着作用时间的延长逐渐受到抑制。加入抑制剂后rhAm及EMPs促进成骨的作用及NF-κB信号通路相关因子的表达均受到抑制。.结论：本研究从基因、蛋白、细胞三个水平上证实了EMPs与rhAm均能明显促进人BMSCs的成骨向分化。并发现两种蛋白可能是通过对NF-kb（P52、P65）及其下游（Fra-1）相关通路的调节作用从而促进成骨。初步探索了BMSCs在rhAm作用下的分子调控机制，也为rhAm今后的临床应用提供了一定的理论依据。