表达产肠毒素大肠杆菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒疫苗的构建及免疫学评价

本项目按照研究计划，完成了研究任务。主要研究内容及研究结果如下：.克隆了产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素（STa）和黏附素K99基因，将二者进行了融合，构建了表达该融合基因的原核表达载体，并对融合蛋白进行了表达纯化。同时，通过将Sta-K99融合基因与腺病毒穿梭质粒重组构建了重组穿梭质粒，采用PacⅠ酶切将其线性化后回收纯化，将腺病毒基因组骨架质粒pAdgenome同样采用PacⅠ酶切线性化后透析法回收，将二者共转染293细胞，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒，采用PCR法和Western blotting对重组腺病毒进行鉴定，在此基础上，通过动物试验对表达STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫原性和安全性进行分析。取得了以下研究结果：（1）成功构建了能表达产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素和黏附素STa-K99融合抗原蛋白的重组腺病毒载体，病毒的病毒滴度 T=1010.6 PFU/mL；（2）构建的重组STa-K99腺病毒载体疫苗能够诱发机体产生较高水平的体液免疫：与对照组相比，重组腺病毒免疫组小鼠在免疫后7d的特异性IgG抗体水平显著升高（p<0.05），在35d达到最大值，与对照组达到极显著差异（p<0.01），直至42d均保持在较高水平；（3）免疫小鼠2周后，Ad.STa-K99免疫组小鼠的脾脏淋巴细胞的增殖活性显著增强，血清中IL-2和IFN-γ含量均明显高于Ad.Blank组及PBS组(p＜0.01)，而这二种细胞因子可以有效促进B淋巴细胞的成熟和分化，促进抗体分泌以及增强巨噬细胞的吞噬活性；（4）构建的重组STa-K99腺病毒载体疫苗能够诱发机体产生较高水平的局部黏膜免疫反应：免疫后7d开始，Ad.STa-K99组sIgA抗体水平明显升高，直至42d均保持在较高水平，且与对照组达到极显著差异；（5）构建的重组STa-K99腺病毒载体疫苗对小鼠的免疫保护率达到了70%。. 研究结果为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定基础。通过本项目的实施，共发表论文6篇，其中SCI收录2篇，核心期刊4篇。培养硕士研究生3名，已毕业2人，在读1人；在本基金项目的资助下，项目组成员先后参加了2011年和2012年中国微生物学会学术年会，项目负责人邓光存应邀参加了2013年第十六届国际动物卫生大会，并作了分会场报告。