内向和外向氯离子转运体介导神经元氯稳态失衡参与肝性脑病的转基因小鼠研究

肝性脑病（hepatic encephalopathy, HE）是肝病患者最常见的并发症和死亡原因之一，发病机制的学说众多，至今尚未完全阐明。黑质网状部（substantia nigra pars reticulate, SNr）是基底神经节释放信号的核心功能集团，由GABA能投射神经元组成。氯离子（Cl－）是细胞内最重要的阴离子，一组功能相反的氯离子转运体，Na+-K+-2Cl－共转运体1（Na+-K+-Cl－ cotransporter 1, NKCC1）和K+-Cl－共转运体2（K+-Cl－ cotransporter 2, KCC2），是调节神经元内的氯离子浓度、调控GABA效应转化的关键因素。本研究使用谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）67-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）转基因小鼠，以解决传统染色方法无法清晰、准确地标记GABA能神经元这一关键问题。本研究首先观察运动迟缓的HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度的改变及与氯稳态相关的两种主要的基因KCC2和NKCC1的表达变化情况。评估使用KCC2和NKCC1特异性抑制剂对小鼠运动能力的影响。然后利用实时定量RT-PCR检测36名患有Ⅲ-Ⅳ期HE的肝硬化患者、20名尚未罹患HE的肝硬化患者及健康对照组的KCC2和NKCC1的mRNA水平。氯离子成像结果显示HE小鼠SNr内GABA能神经元内的氯离子浓度升高。KCC2在mRNA及蛋白水平的表达都下降，在神经元细胞膜处的表达下降尤为明显；与此相反，NKCC1的表达没有明显变化。阻断正常小鼠KCC2可导致运动能力的下降，在肝毒性小鼠可导致运动迟缓进一步加剧。相反，在肝功能衰竭小鼠阻断NKCC1并不能使其运动能力恢复正常。患有HE的肝硬化患者KCC2 mRNA的水平与尚未罹患HE的肝硬化患者及健康对照组相比明显下降。然而，NKCC1 mRNA水平在各组之间无明显差异性。此外，患有HE的肝硬化患者的KCC2 mRNA水平与Child-Pugh评分及血氨水平呈负相关，与Glasgow昏迷评分呈正相关。以上研究表明，氯稳态失衡可能是HE导致的运动迟缓的病理生理学基础，旨在恢复氯稳态的相关药物可能成为治疗肝功能衰竭的潜在性选择，KCC2和NKCC1的表达失衡可能成为预测HE的信号。