钙通道的钙调蛋白依赖性易化与失活的分子机制

Calmodulin（CaM，钙调蛋白）通过与钙离子（Ca2+）结合介导了钙通道的Ca2+（CaM）依赖性易化与Ca2+（CaM）依赖性失活过程，形成了钙通道特有的正负反馈调节机制。本项目探讨了该过程的分子机制，结果如下。（1）采用重组GST融合蛋白技术，建立了大量纯化具有生物活性的CaM及其Ca2+结合位点突变体CaM12、CaM34、CaM1234蛋白的方法。（2）采用半定量GST pull-down assay法和结合量曲线拟合，研究了CaM及其突变体与Cav1.2的C末端蛋白CT1的结合，发现CaM和CaM12与CT1的结合具有浓度依赖性和[Ca2+]依赖性；在高[Ca2+]下，CT1可以结合约两分子的CaM。CaM34和CaM1234与CT1结合时，[Ca2+]依赖性消失，提示CaM的C-lobe起着更为重要的作用。（3）CaM及其突变体也可以与Cav1.2的N末端结合，当[Ca2+]升高至10 μM和2 mM时，CaM与NT结合较明显。（4）CaM半剪切体（N-lobe或C-lobe）均可单独与Cav1.2的C末端结合，而且均存在[Ca2+]依赖性。C-lobe较N-lobe有更高的结合量。（5）CaM半剪切及其突变体均可以与IQ和preIQ基序结合，C-lobe与IQ及preIQ的结合量高于N-lobe的结合量。有趣的是C-lobe与preIQ的结合发生在较高[Ca2+]条件下。（6）CaM的N-lobe和C-lobe均可以与Cav1.2的N末端（NT）结合，结合量随[Ca2+]的增加而增加。C-lobe与NT的结合也需要较高的[Ca2+]。结论：在低和中等[Ca2+]时，Cav1.2可能只能结合一个CaM分子；随着[Ca2+]升高，结合量增加，这可能是通道活性易化的基础；当[Ca2+]进一步升高，或CaM浓度升高时，Cav1.2的C末端可以结合两个分子的CaM，这可能与通道的失活机制相关；CaM与Cav1.2钙通道可以同时形成的N-lobe与Cav1.2的NT，C-lobe与 Cav1.2的 CT，或C-lobe与Cav1.2的NT，N-lobe与 Cav1.2的CT结合的架桥式构型，为Ca2+（CaM）依赖性失活提供了结构基础。研究共发表论文43篇，其中SCI论文10篇，优秀论文奖7篇。培养博士研究生5人，硕士研究生3人，完成了预期目标。