蛋白转导域介导报告蛋白干细胞分子显像的研究

分子显像是新兴的生物医学领域，能够无创、实时、重复和定量地在细胞和亚细胞水平观察和描绘活体生物学过程，报告基因显像是分子显像领域的一个重要组成部分，但目前介导报告基因进入细胞的常用病毒载体尚存在某些不足；同时，目前干细胞治疗已用于多种疾病的治疗，如何在活体条件下监测干细胞体内的分布、移行及存活等，对评价干细胞治疗策略的成败十分重要。本系列研究旨在开发新型的高效安全的载体工具，以介导报告基因进行干细胞移植治疗的分子显像监测。1）杆状病毒是一种新型的可安全感染哺乳动物细胞的新型病毒载体，来自腺相关病毒的反向末端重复序列(ITR)具有增强病毒感染效率和表达时间的作用，本研究通过构建含腺相关病毒ITR结构的杆状病毒(Bac-CMV-hNIS-ITR/Bac-CMV-eGFP-ITR)，介导钠碘同向转运体(NIS)或增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因进行干细胞等治疗细胞移植后的活体监测。体外研究发现，重组杆状病毒对多种治疗细胞均具有较高的感染效率，细胞毒性低，具有较长的表达时间，重组NIS基因杆状病毒可有效地介导放射性碘和高锝酸根的摄取。体内研究结果表明，杆状病毒感染的干细胞在移植后可浓聚放射性核素，靶本比较高，显像效果理想，对干细胞等治疗细胞移植治疗监测的定量研究具有较好的可行性，该研究为活体条件下干细胞移植的监测提供了新策略。2）含蛋白转导域结构的穿膜肽是一种新的运载工具，具有转导蛋白进人细胞的独特功能，转导效能强大，且无明显的毒副作用。单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-tk)可在细胞质内表达，可催化多种核素标记的核苷类似物磷酸化而滞留在细胞内，是一种优良的PET报告基因。本研究通过构建含来源于人免疫缺陷病毒的反式转录激活因子(Tat)基因、来源于流感病毒并经修饰的具有穿透早期核内体功能的血清凝集素蛋白(INF-7)基因、HSV1-tk报告基因或eGFP报告基因的融合蛋白基因(Tat-INF-7-TK/eGFP)表达载体，进行该融合蛋白的原核系统表达及纯化，借此转导干细胞或其他哺乳动物细胞，研究其作为分子显像“报告蛋白”系统监测活体内多种细胞的可行性，体外研究显示，通过原核系统表达的Tat-INF-7-TK/eGFP融合蛋白可经蛋白纯化获得纯度较高的融合蛋白，且对哺乳动物细胞具有较高的转染效率，为进一步研究具有蛋白转导功能的穿膜肽介导报告蛋白进行分子显像提供了基础。