牛肌生成抑制素相互作用蛋白筛选与功能研究

肌生成抑制素（MSTN）是骨骼肌生长的负调控因子，抑制MSTN的功能在畜牧业和临床医学上具有重要意义，而阐明MSTN的调控机制是对MSTN功能调控成功的关键。本项目筛选了牛骨骼肌细胞中与MSTN相互作用的蛋白，并采用免疫共沉淀技术、GST Pull down等技术对筛选到的蛋白进行鉴定，然后利用SPR技术研究这些蛋白质与MSTN相互作用的动力学规律，最后利用基因过表达和RNA干扰等技术研究了MSTN互作蛋白的生物学功能。结果从牛骨骼肌中筛选出MSTN相互作用蛋白4个，利用GST pull down 和蛋白质免疫共沉淀技术从体内体外验证了MSTN相互作用蛋白。利用SPR技术定量研究了MSTN与Decorin、Fibromodulin、T-CAP和TDGF1蛋白相互作用动力学，发现TDGF1相互作用最强。过表达TDGF1基因可抑制成肌细胞增殖，在48h作用最大；添加不同浓度MSTN有同样效果，且过表达TDGF1和同时添加MSTN对成肌细胞增殖的抑制作用最大；进一步研究发现，TDGF1可通过激活MSTN信号通路---Smad蛋白磷酸化和下调MyoD1基因表达而抑制成肌细胞增殖。沉默TDGF1基因可促进成肌细胞增殖，且在48h作用最强，而添加不同浓度的MSTN可显著降低这种作用，且在10μM抑制作用最强，提示TDGF1是MSTN调控成肌细胞增殖的下游分子。沉默TDGF1基因可导致MyoD1、Myf5基因表达量上调和Smad蛋白磷酸化水平降低，添加MSTN可抑制MyoD1基因表达量上调，但对Myf5基因表达量无影响，说明MSTN需要TDGF1基因介导进而通过下调MyoD1基因的表达量从而抑制成肌细胞增殖作用。综合过基因表达和RNA干扰实验结果，MSTN可通过TDGF1激活其信号通路，启动Smad蛋白磷酸化，导致MyoD1基因表达量显著下调从而抑制成肌细胞的增殖作用。上述研究结果不仅为阐明牛MSTN的调控机制提供科学参考，而且也为牛MSTN的调控打开新的思路。