植物凝集素基因在棉花中的功能分析

2014年，是全球转基因作物商业化应用第19个年头，对过去20年全球147个已知转基因作物的最新综合分析表明，转基因技术使化学农药的使用率降低了37％，作物产量提高了22%，农民利润增加了68％，预计增加的作物产量的价值为1333亿美元。但随着抗虫棉的大面积推广，抗虫转基因棉也暴露出一些问题，主要表现在以下方面：非BT靶标害虫（盲蝽象，烟粉虱等）危害加剧、BT靶标害虫抗性增强、外源BT蛋白表达稳定性较差，转基因花粉飘移带来的环境安全问题等。. 在这种背景下，本项目拟克隆新型的杀虫蛋白-植物凝集素，利用新的表达系统-叶绿体转化系统，验证这些抗虫基因在植物抗虫基因工程领域的应用前景。.取得的主要进展如下：. 1.利用转录组学的方法，分离鉴定了多个棉花质体，叶绿体发育的顺式调控元件，这些调控元件将用于新型叶绿体转化载体的构建，为今后优化棉花叶绿体转化体系奠定了基础。. 2.利用叶绿体转化的模式材料-烟草，将从药用植物中分离的半夏凝集素（PTA）和文殊兰凝集素基因(CAA)在烟草叶绿体中高效表达，通过Southern、Northern、Western 杂交以及ELISA 检测外源基因的整合，转录，表达。利用His-tag 技术分离纯化外源凝集素，添加于人工培养基饲喂害虫检测其毒性，结合温室抗虫鉴定，发现转基因烟草具有较强的抗虫（蚜虫，烟粉虱，3 个鳞翅目害虫），抗细菌和病毒的广谱抗性。上述结果表明植物凝集素在植物高效表达的体系中，具有广谱的抗虫效果。.3. 根据已经发表的植物凝集素的序列，克隆到了十个植物凝集素基因，并对这些基因的结构特征、分子进化进行了分析，为今后合理利用不同来源的凝集素基因奠定基础。.4. 对原有的棉花叶绿体转化载体进行了优化，主要体现在选择标记基因的改造、5'-和3'-端顺式调控元件的选择等方面，有望提高外源基因在非绿色组织中的表达效率。.5. 完成了10个植物凝集素基因的细胞核转化载体构建及棉花的遗传转化，其中有半数基因的己经获得转基因植株，PCR检测结果表明，90%以上的转基因植物为阳性，说明我们的遗传转化体系非常高效。. 通过本项目的实施成功克隆了多个植物的凝集素基因，并验证了这些基因在叶绿体高效表达体系下对非BT靶标害虫（蚜虫，烟粉虱等）实现有效控制，为今后开发棉花新型抗虫棉奠定了研究基础。