自交不亲和信号转导途径中磷酸化蛋白质的研究

蛋白质磷酸化是生物体内一种重要的分子调控机制，在细胞信号的传递过程中具有重要的作用。目前认为蛋白质磷酸化与去磷酸化途径参与芸苔属植物的授粉过程。在本课题研究中，为了分离在授粉过程中蛋白质的变化，收集自花授粉与异花授粉后的柱头，采用TCA/丙酮的方法提取柱头的总蛋白质；利用CyDye荧光染料标记样品，进行pH 4-7的胶条2-D电泳分离，利用Typhoon 9400荧光扫描仪扫描样品，应用DeCyder软件进行差异蛋白点分析与筛选。在自交授粉后差异柱头蛋白的分析中，获得了90个差异点；通过MALDI-TOF/TOF质谱分析有46个蛋白被鉴定出来。其中14个蛋白质上调表达，32个蛋白质下调表达；在异交授粉后差异柱头蛋白的分析中，获得了50个差异点，有19个蛋白被成功的鉴定出来。其中有8个蛋白质上调表达，11个蛋白质下调表达。这些蛋白质主要是参与代谢途径、胁迫反应、蛋白酶抑制剂、分子伴侣、细胞壁重组、信号转导等。由于磷酸酶处理前后磷酸化蛋白的分子量及等电点会发生变化，反应在DIGE凝胶上则是蛋白点表达量的变化。利用磷酸酶处理授粉后样品，检测到132个在磷酸酶处理前后电泳迁移率发生变化的蛋白。利用MALDI-TOF-TOF质谱分析，得到73个蛋白的高可信度注释信息。将获得的磷酸化蛋白利用GO进行了分析，刺激响应蛋白占较大比重，分类中包含生物刺激响应、胁迫响应、主要代谢过程、单个-多个细胞生物体过程、有机物代谢过程、细胞代谢过程等。通过分析上述获得的差异蛋白，筛选Bnm1基因，peroxiredoxin-2B基因、Lactoylglutathione lyase基因、Cysteine synthase基因和glutamine syhthetase cytosolic isozyme 1-2基因进行克隆和分离。利用实时定量PCR技术，检测基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶和柱头的相对表达量情况。通过原核表达纯化技术获得筛选到目的基因的融合蛋白和SRK13b的激酶域融合蛋白。在体外的激酶检测中，进行SRK13b激酶的下游底物筛选，但目前没有获得阳性结果。在亚细胞定位研究中发现，peroxiredoxin-2B、Lactoylglutathione lyase在细胞质和细胞核内都有表达。通过上述研究，为授粉过程和自交不亲和信号通路的研究提供了线索。