Mechanisms of replication fork protection and recovery

摘要：许多化疗药物通过诱导DNA损伤干扰DNA来杀死癌细胞 复制的复制叉可以逆转以帮助修复化疗药物诱导的DNA损伤， BRCA蛋白质是保护反向叉免于核溶解降解的关键。 如果没有BRCA， 反向复制叉被核酸酶广泛降解，导致化学敏感性。 此外，委员会认为， 化疗耐药性与BRCA-CRP缺陷细胞保护叉子免于降解的恢复能力有关 其机制尚不清楚 因此，了解细胞如何保护停滞的DNA复制叉 并促进他们的恢复对于发展和改进癌症治疗策略至关重要。在 在这个应用中，我们联合收割机结合了Zou和Vindigni实验室的专业知识来研究其机制 BRCA 1基因表达阳性（Aim 1）和缺失（Aim 2）的细胞中DNA复制叉保护和恢复。 的 Zou实验室在ATR信号通路方面拥有丰富的经验，这对于稳定基因组至关重要。 DNA复制。Vindigni实验室发现了分叉逆转途径的主要步骤。一起工作， 我们已经发现了一些涉及分叉保护的新玩家。 在初步研究中， 目标1，我们发现ATR在保护停滞/反转复制叉方面发挥了以前未被认识到的作用 来自BRCA 1基因表达的细胞中的溶核降解。 我们还表明，ATR是需要有效的 恢复停滞的叉子。基于这个前提，我们假设ATR在本地作用于停滞的复制叉 以保护反向叉免于溶核降解并促进它们在药物去除后重新启动。目标1将 确定ATR在BRCA 1-ESTA中保护停滞/反转的分叉并促进分叉重新启动的机制 熟练的细胞在目标2的初步研究中，我们已经研究了如何保护失速叉 以及它们如何在缺乏BRCA 1的细胞中恢复。我们发现BRCA 1-BRCA 2中广泛退化的复制叉 缺陷细胞可以通过由Rad 18和Ubc 13介导的途径恢复。 此外，当BRCA 1 缺陷细胞获得PARP抑制剂抗性，通过PALB 2-β依赖性机制恢复叉保护， 它依赖于ATR活性。 值得注意的是，Ubc 13和PALB 2都与E3泛素连接酶功能性连接 RNF 168，提高了Ubc 13，RNF 168和PALB 2可能在同一轴上起作用以保护失速的叉子的可能性 并独立于BRCA 1促进fork恢复。 我们假设Ubc 13和PALB 2都有 在没有BRCA 1的情况下，在分叉恢复/保护中发挥意想不到的作用，它们的功能可能通过以下方式联系起来： RNF168。 目的2将研究Ubc 13如何促进BRCA 1-β缺陷细胞中的叉恢复，PALB 2和 ATR保护BRCA 1-β缺陷型PARP抑制剂-β 2抗性细胞中停滞的分叉，以及Ubc 13-β RNF 168-β 2是否能抑制BRCA 1-β缺陷型PARP抑制剂-β 2抗性细胞中停滞的分叉。 在缺乏BRCA 1的情况下，PALB 2轴可以促进分叉保护和分叉恢复。总的来说，这些研究 将改变目前在BRCA 1基因表达正常和缺乏BRCA 1基因的细胞中分叉稳定和恢复的模型， 利用癌细胞中的复制应激的新治疗策略的机制基础。

Summary:  Many  chemotherapeutics  kill  cancer  cells  by  inducing  DNA  damage  interfering  with  DNA  replication. Replication forks can reverse to aid the repair of DNA damage induced by chemotherapeutics, and  BRCA  proteins  are  key  to  protecting  the  reversed  forks  from  nucleolytic  degradation.  In  absence  of  BRCA,  reversed  replication  forks  are  extensively  degraded  by  nucleases,  leading  to  chemosensitivity.  Moreover,  chemoresistance has been linked to the restored ability of BRCA-­deficient cells to protect forks from degradation  through  mechanisms  that  remain  unclear.  Thus,  understanding  how  cells  protect  stalled  DNA  replication  forks  and promote their recovery is critically important for developing and improving strategies for cancer therapy. In  this application, we combine the expertise from the Zou and Vindigni laboratories to investigate the mechanisms  of  DNA  replication  fork  protection  and  recovery  in  BRCA1-­proficient  (Aim  1)  and  -­deficient  (Aim  2)  cells.  The  Zou lab has extensive experience in the ATR signaling pathway, which is crucial for stabilizing the genome during  DNA replication. The Vindigni lab has discovered principal steps of the fork reversal pathway. Working together,  we  have  uncovered  a  number  of  new  players  involved  in  fork  protection.  In  the  preliminary  studies  leading  to  Aim  1,  we  found  that  ATR plays a  previously unrecognized  role  in protecting  stalled/reversed  replication  forks  from  nucleolytic  degradation  in  BRCA1-­proficient  cells.  We  also  showed  that  ATR  is  required  for  the  efficient  recovery of stalled forks. Based on this premise, we hypothesize that ATR acts locally at stalled replication forks  to protect reversed forks from nucleolytic degradation and to promote their restart after drug removal. Aim 1 will  determine  the  mechanisms by  which  ATR protects  stalled/reversed forks and promotes  fork  restart in  BRCA1-­ proficient cells. In the preliminary studies leading to Aim 2, we have investigated how stalled forks are protected  and how they recover in cells lacking BRCA1. We found that extensively degraded replication forks in BRCA1-­ deficient  cells  can  recover  through  a  pathway  mediated  by  Rad18  and  Ubc13.  Furthermore,  when  BRCA1-­ deficient cells acquire PARP inhibitor resistance, fork protection is restored via a PALB2-­dependent mechanism,  which  relies on ATR  activity.  Notably,  both  Ubc13  and  PALB2  are  functionally  linked  to the  E3  ubiquitin  ligase  RNF168, raising the possibility that Ubc13, RNF168, and PALB2 may act in the same axis to protect stalled forks  and  promote  fork  recovery  independently  of  BRCA1.  We  hypothesize  that  both  Ubc13  and  PALB2  have  unanticipated  roles  in  fork  recovery/protection  in  the  absence  of  BRCA1,  and  their  functions  may  be  linked  by  RNF168.  Aim 2  will  investigate how  Ubc13 promotes  fork  recovery  in BRCA1-­deficient  cells,  how PALB2 and  ATR  protect  stalled  forks  in  BRCA1-­deficient  PARP  inhibitor-­resistant  cells,  and  whether  a  Ubc13-­RNF168-­ PALB2 axis promotes both fork protection and fork recovery in the absence of BRCA1. Collectively, these studies  will transform current models of fork stabilization and recovery in BRCA1-­proficient and -­deficient cells, providing  a mechanistic basis for new therapeutic strategies that exploit the replication stress in cancer cells.